线粒体融合蛋白2（mitofusin 2,Mfn2）是由我国学者陈光慧教授于1997年首先发现的一个与高血压有关的新基因。该基因在正常大鼠血管平滑肌中高表达,而在自发性高血压大鼠的血管平滑肌中低表达,最初该基因被命名为高血压相关基因（hypertension related gene, HRG）。后来发现该基因产物可以抑制Ras-raf-ERK-MAPK途径,从而有效地阻遏细胞周期和抑制细胞增殖,遂更名为增殖抑制基因（hyperplasia suppressor gene, HSG）。后来证明该基因产物可以促进线粒体的融合,遂更名为线粒体融合蛋白2基因。Mfn2不仅在血管平滑肌中表达,在心、脑、肺、肾、肝、骨胳肌、棕色脂肪组织中表达量也很高,其中以心肌、骨骼肌、棕色脂肪组织中表达量最高,在脑、肾、肝、肺、睾丸表达量稍次。Mfn2定位于线粒体外膜,是促进线粒体融合所必需的,参与调节线粒体的形态。已有证据表明,Mfn2参与线粒体代谢调节。阻抑Mfn2可使葡萄糖氧化、线粒体膜电位以及细胞呼吸下降。肌肉细胞中Mfn2的表达变化可以引起呼吸链亚基的表达出现平行的变化。过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）是新近发现的多种核受体的共激活因子,在多种基因的上游都有结合位点,分别调节这些基因的转录,从而在多种方面发挥作用。目前已知,它的影响范围包括线粒体生物发生、适应性产热作用、糖代谢调控、脂肪酸氧化调控、肌纤维类型调控、呼吸、胰岛素分泌和糖原异生等诸多生物过程。最近有人发现Mfn2基因的启动子区域含有PGC-1α和雌激素相关受体α（ERRα）的顺式作用元件,Mfn2基因的表达受到后两者的诱导。本课题的第一部分利用高脂饮食喂养建立大鼠胰岛素抵抗模型和罗格列酮干预模型,来观察PGC-1α和Mfn2基因的表达变化,并统计线粒体形态指标在这两种模型中的变化趋势,探讨PGC-1α、Mfn2基因和线粒体在胰岛素抵抗形成中的机制,探讨PGC-1α、Mfn2基因和线粒体在罗格列酮改善胰岛素抵抗的机制。代谢综合征的各种病理机制中,氧化应激是一个重要的方面,氧化应激在细胞凋亡中发挥着重要作用,许多代谢综合征的发生、发展及并发症的出现,都与氧化应激所致的细胞凋亡有关。线粒体是氧化应激各活性分子产生的一个主要场所,也是介导凋亡的主要效应细胞器。已有初步的证据表明Mfn2参与线粒体介导的细胞凋亡。但是它在其中的作用,仍有争论,一部分学者认为Mfn2是细胞凋亡的效应分子,促进细胞凋亡;另外有学者认为Mfn2具有抗凋亡的作用,是在凋亡刺激因素下诱导表达的保护性分子,本课题第二部分试图澄清这一争论。同时我们考虑到,代谢综合征具有明显的遗传倾向,多种基因与肥胖、高血压、糖尿病、动脉粥样硬化性心脏病、高脂血症等疾病具有明显的相关性。对于我们关注的Mfn2基因,是否存在突变位点或多态性位点,从而导致其表达升高或降低,或者功能出现异常,从而导致某类代谢综合征如糖尿病的易感性,是本课题第三部分关注的问题。本课题三部分的具体内容如下:第一部分胰岛素抵抗及罗格列酮干预大鼠骨骼肌PGC-1α和Mfn2基因的表达变化目的:通过对高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠骨骼肌PGC-1α和Mfn2基因表达和线粒体形态的研究,了解PGC-1α和Mfn2与胰岛素抵抗发生的相关性;并通过罗格列酮的干预,观察罗格列酮对PGC-1α和Mfn2的表达和线粒体形态的影响。方法:成年Wistar大鼠随机分为对照组（NC）、高脂组（HF）和高脂罗格列酮干预组（HF+RSG）。对照组给予普通饲料,其余两组给予高脂饲料。喂养4周时,大鼠心脏采血用于生化指标的检测。清醒状态下用正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术评价检测各组葡萄糖输注率,评价胰岛素抵抗状态。高脂饮食的两组大鼠胰岛素抵抗状态形成。罗格列酮干预组增加罗格列酮灌胃,其余两组给予等量生理盐水。第8周时,大鼠心脏采血用于生化指标的检测。清醒状态下用正常葡萄糖高胰岛素钳夹技术检测各组葡萄糖输注率,再次评价胰岛素抵抗状态。动物放血处死取材,快速冻于液氮,储存于-70℃冰箱中。实时定量PCR和Western blot检测骨骼肌PGC-1α和Mfn2的表达;透射电镜观察骨骼肌线粒体的形态变化;Image-Pro Plus 6软件分析电镜照片中线粒体形态的各项参数。结果:1.高脂饮食4周,大鼠葡萄糖输注率降低,胰岛素抵抗大鼠模型成功;罗格列酮可改善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗状态。2.实时定量PCR结果表明,正常对照组和高脂罗格列酮干预组骨骼肌PGC-1αmRNA拷贝数没有显著差异,而高脂组拷贝数明显减少,与正常对照组和高脂罗格列酮干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。Mfn2 mRNA的拷贝数,正常对照组最高,高脂组最低,高脂罗格列酮干预组处于二者之间,三组之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。3. Western印迹显示,正常对照组和高脂罗格列酮干预组骨骼肌PGC-1α蛋白的表达没有显著差异,而高脂组表达量明显减少,高脂组与正常对照组和高脂罗格列酮干预组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。Mfn2蛋白的表达,正常对照组最高,高脂组最低,高脂罗格列酮干预组处于二者之间,三组之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。4.透射电镜观察表明,与正常对照组相比,高脂组肌纤维间线粒体体型明显减小,比较细碎。而在肌膜下则分布众多体型较大的线粒体,且线粒体常常出现髓样化、致密化或肿胀等代谢障碍的典型现象。电镜照片经Image-Pro Plus 6软件进行数据统计,发现与正常对照组相比,高脂组的线粒体面积、直径及线粒体占肌纤维体积百分比均明显下降（P<0.05）,而高脂罗格列酮干预组各项指标与正常对照组相比无明显差异。小结:1.长期高脂饮食,可引起PGC-1α和Mfn2基因表达活性下降和线粒体形态异常,这些变化参与了胰岛素抵抗状态的形成。2.罗格列酮改善胰岛素抵抗状态的机制,可能与罗格列酮调节PGC-1α和Mfn2两基因的表达、维持正常线粒体的形态及功能有关。第二部分Mfn2对氧化应激所致细胞凋亡的影响及其作用机制目的:为了探讨Mfn2对线粒体氧化还原功能的影响,本部分用野生型（pEGFP-Mfn2质粒）和显性激活突变型（pEGFP-Mfn2G12V质粒）质粒转染HEK293细胞,然后用半致死剂量的H2O2处理细胞,观察Mfn2及其突变形式在氧化应激所致细胞凋亡中的作用机制。方法:1.不同浓度H2O2对细胞凋亡的影响:用含10 %新生小牛血清的DMEM培养HEK293细胞,接种于96孔板中,培养24h后,加入H2O2,设置不同的浓度梯度。孵育2小时。更换新鲜培养基,继续培养24h。每孔加入10μl CCK-8溶液以检测细胞活性,在细胞培养箱内继续孵育4小时,用酶标仪在450nm处测定吸光度。确定诱导细胞凋亡的最适H2O2浓度N。2.不同浓度H2O2对Mfn2表达的影响:基本步骤同前,细胞接种6孔板。加入H2O2,使终浓度分别为0、1/2N、N、2Nμmol/L。提取细胞总蛋白,进行Western印迹分析。3.细胞转染效率观察:质粒的转化、提取及酶切鉴定依常规方法进行。细胞接种6孔板,设置不同的质粒浓度,使用梭华-SofastTM转染试剂进行转染。细胞培养24h后,利用质粒携带的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下检测转染细胞,计算细胞转染效率。4. CCK-8试验:细胞分为4组,分别为:未处理组（转染pEGFP-C1空质粒,不加H2O2处理）、空质粒组（转染pEGFP-C1空质粒,加H2O2处理）、Mfn2组（转染pEGFP-Mfn2质粒,加H2O2处理）、Mfn2 G12V组（转染pEGFP-Mfn2G12V质粒,加H2O2处理）。用CCK-8试验评价细胞活性。5. Hoechst染色:方法及分组同上,通过Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察并拍照,计算细胞凋亡率。6. AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞检测:方法及分组同前,细胞经AnnexinⅤ-FITC/PI双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.线粒体膜电位检测:方法及分组同前,细胞经JC-1染色后,用流式细胞仪分析红绿荧光所占的比率。8. caspase-3活性检测:方法及分组同前,各组细胞中加入caspase-3的底物AC-DEVD-pNA,使其终浓度为50μmol/L,反应后采用酶标免疫测定仪测定波长405nm下的吸光度值,以此表示caspase-3的相对活性。9. Western印迹检测:方法及分组同前,提取细胞总蛋白,进行Western印迹分析。检测蛋白为:Mfn2、Cyt c、Bcl-2和Bax。结果:1. H2O2浓度在40¹00μmol/L之间时,HEK293细胞的凋亡率与浓度呈线性正相关。致使约半数细胞凋亡的H2O2浓度为80μmol/L。2. Mfn2蛋白的表达与H2O2浓度存在剂量依赖效应,在所选择的四个浓度范围内（0,40,80,160μmol/L）蛋白表达量随着H2O2浓度的升高而升高。3. HEK293细胞使用梭华-SofastTM转染试剂进行质粒转染,可获得较高的转染效率,基本在85%以上,所选择的3个质粒浓度（1、1.5、2μg）的转染效率基本一致。4. CCK-8试验、Hoechst染色及AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞检测结果均表明未处理组的细胞凋亡率最低,空质粒组最高,而Mfn2组细胞凋亡率大大降低,Mfn2G12V组细胞凋亡率更低。5.各组细胞凋亡率的差异与线粒体膜电位的变化有关,转染Mfn2的细胞具有较高的膜电位和较低的细胞凋亡率。6.对各组细胞Caspase-3活性进行检测,发现未处理组活性最低,空质粒组活性最高,Mfn2组和Mfn2G12V组比空质粒组明显降低。7. Mfn2组和Mfn2G12V组可检测到增强的Mfn2特异性条带,证明两组细胞转染野生型或突变型Mfn2质粒成功。Bcl-2的表达以空质粒组为最低,其余各组均较高,其余个组之间没有明显差别。Bax表达以空质粒组为最高,其余各组均较低,其中Mfn2组Bax的表达略高于未处理组和Mfn2G12V组。Cyt c的表达以空质粒组为最高,其余各组均较低,其余个组之间没有明显差别。小结:在本课题所选择的H2O2浓度范围下,Mfn2针对H2O2所诱导的HEK293细胞凋亡具有保护作用,其作用机制涉及到线粒体膜电位的升高、Caspase-3活性下降,还与Bcl-2蛋白的表达增加及Bax和Cyt c蛋白的表达下降有关。第三部分Mfn2启动子区PGC-1α及ERRα顺式作用元件的多态性与2型糖尿病的相关性分析目的:为了寻找Mfn2与糖尿病发生相关的进一步证据,本部分通过筛查Mfn2的启动子区PGC-1α和ERRα的顺式作用元件附近,是否存在多态性位点,比较研究这些多态性位点与临床糖尿病发生的相关性。方法:选取确诊的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）住院病人100例,另选取年龄、性别相匹配的健康体检者112例,取4ml EDTA-K2抗凝血,一部分进行常规生化检验,一部分提取基因组DNA。在Mfn2的启动子区PGC-1α和ERRα的顺式作用元件附近设计相应的引物,PCR扩增,用单链构象多态性分析的方法来筛选差异个体。对PCR产物进行测序,测序结果用DNAMAN软件与GenBank公布的Mfn2（NM₀14874）启动子区序列进行比对,找出多态性位点。运用基因计数法计算各组基因频率及等位基因频率,运用Hardy-Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性。χ2检验分析多态性位点的分布在2型糖尿病组和健康对照组之间是否存在差异。结果:1.在Mfn2启动子附近,PGC-1α和ERRα顺式作用元件的下游,转录起始位点的上游,发现3个多态性位点,分别是-166A/G多态性位点,-45A/G多态性位点,+110T/C多态性位点。2.这三个多态性位点,具有一定程度的连锁性,基本规律是AAT/GGC,其中前两个多态性位点在所考察的212个个体中,全部连锁（100%）。而第三个位点的连锁率为87.7%。3.经过χ2检验,这三个多态性位点在2型糖尿病人群和健康对照人群的基因型频率和等位基因频率都没有显著性差异。小结:在Mfn2启动子附近新发现了3个多态性位点,其基因型频率和等位基因频率的差异在2型糖尿病人群和健康人群之间无统计学意义。综合上述三部分内容,本研究得出如下结论:1长期高脂饮食,可引起PGC-1α和Mfn2基因表达活性下降和线粒体形态异常,这些变化参与了胰岛素抵抗状态的形成。罗格列酮改善胰岛素抵抗状态的机制,可能与罗格列酮调节PGC-1α和Mfn2两基因的表达、维持正常线粒体的形态及功能有关。2在本课题所选择的H2O2浓度范围下,Mfn2针对H2O2所诱导的HEK293细胞凋亡具有保护作用,其作用机制涉及到线粒体膜电位的升高、Caspase-3活性下降,还与Bcl-2蛋白的表达增加及Bax和Cyt c蛋白的表达下降有关。3在Mfn2启动子附近新发现了3个多态性位点,其基因型频率和等位基因频率的差异在2型糖尿病人群和健康人群之间无统计学意义。