在农业生产上,植物病害的防治一直是一个重要的环节,尤其是对于由真菌引起的病害。多数病害的防治主要依赖于化学农药的使用,但该使用易对环境造成污染,危害人类牲畜的健康。所以,人们应该考虑应用生物防治方法来控制植物病害。其中球毛壳菌(Chaetomium globosum)是目前研究用于生物防治的有益真菌,它产生细胞壁水解酶如β-1,3-葡聚糖酶,细胞壁水解酶破坏植物病原真菌细胞壁,杀死植物病原真菌。因此,球毛壳菌(C. globosum)是生物防治分子机理研究和优良生物防治基因克隆的理想生物材料。为了利用重组β-1,3-葡聚糖酶生产生物农药,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)容易培养、外源蛋白表达量高等特点,本研究采用GS115毕赤酵母分泌表达系统作为表达工具。首先利用生物信息学手段,即BLASTX相似性搜索从已构建的球毛壳菌EST库中筛选得到β-1,3-葡聚糖酶基因(glu)的5’和3’端,设计引物扩增出球毛壳菌β-1,3-葡聚糖酶基因,并提交GenBank,得到的序列号为FJ587923。然后用立枯丝核菌诱导球毛壳菌后提取球毛壳菌RNA,经反转录和PCR扩增后得到β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA序列。将经EcoR I和Not I双酶切的β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA和酵母表达载体pPIC9K进行体外连接,构建酵母重组表达载体,得到重组表达质粒pPIC9K-glu。将pPIC9K-glu和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶BspEⅠ线性化后,电转化GS115毕赤酵母感受态细胞,转化子经甲醇利用表型筛选和PCR检测筛选得到2株低效利用甲醇的阳性转化子。对这两株阳性转化子发酵后取上清进行SDS-PAGE检测和酶活测定得到1株高效表达β-1,3-葡聚糖酶的阳性转化子。对上述得到的转化子进行酶活测定与酶学特性研究,并对重组GLU的抑菌性进行了初步研究。发现该GS115转化子在第3天出现产酶高峰,重组GLU在温度为45℃时酶活性最高。根据该发酵条件,以昆布多糖为底物测得的重组GLU发酵液上清酶活为1.31U。另外,分别以尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、核盘菌(S. sclerotiorum)、立枯丝核菌(R. solani)、稻瘟病菌(P. grisea)、叶枯病菌(S. tritici),杨树烂皮病菌(V. sordida)的细胞壁作为底物,测定重组GLU粗酶液的酶活性。结果表明,重组GLU对植物病原真菌尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、立枯丝核菌(R. solani)、稻瘟病菌(P. grisea)比对核盘菌(S. sclerotiorum)、叶枯病菌(S. tritici)、杨树烂皮病菌(V. sordida)的细胞壁的酶活性要高,说明重组GLU对前三种植物病原真菌细胞壁的水解作用更明显,间接证明了重组GLU对尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、立枯丝核菌(R. solani)、稻瘟病菌(P. grisea)具有更好的抑制作用。通过转化毕赤酵母GS115得到的重组GLU具有较高的酶活性,且对某些植物病原真菌有较明显的生物防治作用,所以该研究具有较高的理论意义和实际应用价值。