目的： 心肌L-型钙通道(Cavl.2)参与心肌兴奋-收缩耦联和其他重要的电化学活动。钙调蛋白(CaM)结合于L-型钙通道α亚基C-末端的不同位点可以引发钙依赖性激活(CDF)和钙依赖性失活(CDI)。电压门控性L-型钙通道特有的现象“衰减”，即在膜片钳全细胞或内面向外的单通道记录式中，当胞浆侧用人工细胞内液灌流时，L-型钙电流就会急剧的下降或消失，这种现象被称为“衰减”，它的机制主要是细胞因子的丢失。本实验在豚鼠心室肌细胞上，应用内面向外的膜片钳单通道记录式研究突变的CaM对“衰减”后钙通道活性的影响，来探讨CaM上不同的钙离子结合位点与L-型钙通道活性的相互关系，即CaM的N-叶和C-叶上的钙离子结合位点究竟谁与CDF相关，谁与CDI相关。从分子水平上揭示钙调蛋白对L-型钙通道的调节机制。 材料与方法: 一、突变蛋白CaM12、CaM34的提取 CaM12，即钙调蛋白四个钙离子结合位点中，位于氨基叶(N-lobe)上的1、2位点分别点突变，使其失去钙离子的结合能力。CAM34，即钙调蛋白四个钙离子结合位点中，位于羧基叶(C-lobe)上的3、4位点分别点突变，使其失去钙离子的结合能力。 CaM12的提取过程是，编码位点2已突变的钙调蛋白的目的基因存在于质粒载体pGEX-6P-3当中，用质粒DNA提取试剂盒(QIAGEN Plasmid Purification Handbook)提取pGEX-6P-3质粒DNA。再用限制性核酸内切酶(Apa-I)将质粒DNA切成两段，加入设计好的含位点1特异性点突变基因的引物(primer-1F和primer-1R)跑PCR。用Dpn I消化甲基化的和没有变异的模板，将其转化入受体细胞BL21(DE3)中，于LB培养基37摄氏度孵育过夜。培养克隆株并检测基因序列。类似的方法提取CaM34。 二、单个心室肌细胞的制备 健康成年豚鼠，体重300～600克，雌雄不限，用苯巴比妥钠(6.6mg/100g)腹腔注射麻醉。气管插管行辅助呼吸，在体条件下主动脉插管，取出心脏，用Langendorff灌流装置进行灌流及消化[胶原酶(208051)2％及胶原酶(208052)3％，温度39℃]。再用蛋白酶和DNA酶37℃孵育以使细胞表面光滑。之后离心两次置于4℃冰箱中冷藏备用。 三、膜片钳内面向外式单通道电流记录和数据分析 应用AXOPATCH 200B膜片钳放大器，在内面向外的膜片记录式下，对豚鼠心室肌细胞的L-型钙通道的单通道电流进行记录。通过钙通道的钡离子流由-70至0mV的去极化脉冲引出，波宽200ms，刺激频率0.5Hz,输出常数a×100，经由膜片钳放大器记录后以3.3kHz的采集速率输入计算机，减去漏电流。 单通道电流在细胞贴附式下记录两分钟，之后抬起玻璃微电极使其形成内面向外的膜片记录式，维持一分钟，立即加药(CaM+ATP)，等待至少20分钟以观察电流的恢复情况。 应用公式I=N×Poxi，其中I是测定实验脉冲开始后5～105ms期间的平均电流，i是单通道电流幅值，N为膜片中的通道数目，Po为通道的平均时间开放频率，NPo代表通道开放频率，计算出NPo的大小，再以在无钙灌流液中稳定记录3分钟的平均NPo值作为细胞的基础NPo,以其作为参照，计算出通道的相对NPo值来进行分析。本实验的效应指标是通道活性恢复百分比(Channel Activity)，指的是通道活性恢复峰值期的平均NPo与细胞贴附记录式下的平均NPo的比值。 实验结果用均值±标准误表示，数据用Students t检验统计分析，p<0.05为显著差异。 结果: 一、分子生物学实验结果 应用特异性点突变提取试剂盒提取突变蛋白CaM12。检测钙调蛋白4个编码钙离子结合位点基因的碱基序列，其86位的胸腺嘧啶变成胞嘧啶，即所编码的氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸，位点1突变成功。第194位的胸腺嘧啶变为胞嘧啶，其编码的氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸，位点2突变。位点3、4的碱基序列同野生型钙调蛋白一致，没有发生突变。类似的方法提取突变蛋白CaM34，检测钙调蛋白4个编码钙离子结合位点基因的碱基序列，其295和296位的A、G分别变成T、T，即所编码的氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸(S101F)，位点3突变成功。第413位的A变为C，其编码的氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸(E140A)，位点4突变。位点1、2的碱基序列同野生型钙调蛋白一致，没有发生突变。电泳(SDS-PAGE)结果看其浓度和纯度，浓度和纯度都很高。应用Infinite-200(Tecan公司)测其精确浓度，i-Control软件分析得出蛋白580nm波长处的吸光度数据，与BSA标准液进行浓度对照，得出CaM12的精确浓度为0.73mg/ml，CaM34的精确浓度是1.59mg/ml。 二、电生理学实验结果 (一)CaM34对L-型钙通道活性的恢复作用呈现剂量依赖性和钙离子浓度依赖性 选取中间钙离子浓度(250nM)CaM34数据点中具有代表性的柱状电流图直观地反映CaM34恢复通道活性的浓度变化趋势。结果显示，在一定钙离浓度下，CaM34对通道活性恢复的百分比随浓度的增高先升高后降低，呈现“钟型”的曲线变化趋势。在不同钙离子浓度0、250、500nM时，观察不同浓度的CaM34(0.35、0.7、1.4、2.1、3.5μM)对“衰减”后钙通道活性的影响。结果显示，在一定钙离子浓度下，CaM34对“衰减”后钙电流的恢复效果同CaM34，的浓度呈“钟型”相关。当升高钙离子浓度([Ca2+]<1μM)时，通道活性恢复曲线的激活相无明显变化，而失活相随着钙离子浓度的增大而逐渐提前。选取0.7、1.4、2.1、3.5μM钙调蛋白各浓度点做柱状图比较器不同钙离子浓度间的差别，结果显示，当CAM34的浓度由低到高递增时，钙离子浓度越高越早出现具有统计学差异的减小。也就是说，较低浓度点的不同钙离子浓度的复活百分比比较无统计学差异，即钙离子对激活相无影响；较高浓度点，钙离子浓度越高越早出现具有统计学意义的复活百分比的减小，即钙离子浓度越高失活相就越提前。 (二)CaMl2对L-型钙通道作用的剂量依赖性和钙离子浓度依赖性 选取中间钙离子浓度(250nM)CaM12数据点中具有代表性的柱状电流图直观地反映CaM12恢复通道活性的浓度变化趋势。结果显示，在一定钙离浓度下，CaM12对通道活性恢复的百分比随浓度的增加而升高，呈现浓度依赖性的正相关曲线变化趋势。在不同钙离子浓度0、250nM时，观察不同浓度的CaM12(0.35、0.7、1.5、3.5、7μM)对“衰减”后钙通道活性的影响。结果显示，在一定钙离子浓度下，CaM12对“衰减”后钙电流的恢复效果同CaM12的浓度呈正相关。当升高钙离子浓度([Ca2+]<1μM)时，通道活性恢复曲线的激活相左移，无明显的失活相。选取0.35、0.7、1.5、3.5、7μM钙调蛋白各浓度点做t-检验比较不同钙离子浓度间CaM12对通道作用的差别，结果显示，在相应的钙调蛋白浓度下，钙离子浓度为250nM时的通道活性恢复百分比高于钙离子浓度为0nM时的通道活性恢复百分比。也就是说，钙离子浓度越高激活相越提前出现，在0.35~7μM的CaM12浓度下无明显的失活效应。 结论: CaM12、CaM34对心肌L-型钙通道活性的恢复作用呈现浓度和钙离子依赖性； 钙离子可以增强CaM12对通道的激活作用，而对失活作用影响不明显，提示CaM C-叶与CDF相关。 钙离子可以增强CaM34对通道的失活作用，而对激活作用影响不明显，提示CaM N-叶与CDI相关。