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海洋生物蛋白是不同结构功能物质的理想、丰富的贮库,尤其是一些海洋低值鱼类是制备生物活性肽理想的初始原料。以海洋低值鱼类为原料制备、分离降血压肽正成为当今一个研究热点。长蛇鲻(Saurida elongata),长蛇鲻属,狗母鱼科,主要分布于西北太平洋,为广西北部湾经济鱼类之一。本实验以长蛇鲻为原料,蛋白组成分析显示长蛇鲻是一种高蛋白原料,湿基粗蛋白15.34%,干基粗蛋白78.35%,含有18种氨基酸,氨基酸总含量达到791.41mg·g-1,其中8种人体必需氨基酸占总量的44.92%,非极性、疏水性氨基酸39.13%,极性氨基酸占总含量的60.87%。本实验选用六种蛋白酶水解长蛇鲻鱼肉蛋白,通过体外ACE抑制活性测定,筛选中性蛋白酶作为制备血管紧张素转化酶抑制肽(ACEI)的蛋白酶,其酶解产物对ACE抑制活性IC50为0.182mg·mL-1。以水解度DH(Y1)和产物对ACE抑制率IP(Y2)双指标为参数,采用响应面设计法考察了酶解温度、pH值、酶/底(E/S)对水解度及抑制率的影响,优化得到二元多次方程：Y1=23.77-0.81X1+3.21X2-1.65X3-0.84X1X2-0.35X1X3-0.95X2X3-1.76X12-0.99X22-0.33X32；Y2=83.32-2.27X1+2.94X2-2.02X3-0.33X1X2-1.76X1X3+1.64X2X3-3.35X12-3.39X22-2.30X32,并确定了最适酶解工艺条件为：E/S为10000U-g-1、温度为48℃、pH为7.0及水解时间120min,在此工艺条件下水解度为24.07%,ACE抑制率为84.00%。利用超滤(UF)和凝胶层析(GFC)对酶解物进行初步分离。酶解物经超滤分离后活性组分得到富集,5kDa渗透液(LFPH-I)的IC50值为0.123mg·mL-1。采用凝胶层析对LFPH-I进一步分离,考察了各因素对凝胶层析的影响,得到最优条件：柱规格(1.6cm×45cm)、蒸馏水洗脱1.0mL·min-1、上样量为20mg。在此条件下,可将LFPH-I分成A. B、C、D、E五个组分,其中C组分(LFPH-I-C)活性最高,IC50为0.110mg·mL-1。考察了LFPH-I的抗胃肠道稳定性能,实验表明LFPH-I经胃蛋白酶消化后活性略有上升；经胰蛋白酶作用稳定性良好,但LFPH-I经胃蛋白酶作用后再用胰蛋白酶处理则活性有所下降。采用离子交换色谱-反相高效液相色谱法结合(IEC/RP-HPLC法)分离纯化LFPH-I-C,得到活性组分G3；同时研究了连续多步反相高效液相色谱法(RP-HPLC/RP-HPLC/RP-HPLC法)分离纯化LFPH-I-C,得到活性组分U73D。经反相高效液相色谱和高效毛细管电泳检测二者均为单一组分。通过飞行时间质谱鉴定了G3和U73D结构,解析其氨基酸序列分别为Arg-Val-Cys-Leu-Pro (RVCLP)和Ser-Pro-Arg-Cys-Arg (SPRCR),ICso值分别为175μM和41μM。固定化金属离子亲和分离技术(IMAC)在重组蛋白和重组多肽的分离纯化中己得到广泛应用。在采用IEC/RP-HPLC法及RP-HPLC/RP-HPLC/RP-HPLC法分离纯化LFPH-I-C得到长蛇鲻降血压肽结构基础上,探索了IMAC分离长蛇鲻降血压肽的方法。以反相悬浮法制备琼脂糖微球载体,确定了最佳制备工艺为琼脂糖浓度2.5%,乳化剂用量1.5%,乳化温度60℃,搅拌速度400rmin-1,此时获得的目标微球载体成球率为70.80%。以环氧氯丙烷为活化剂,确定了最佳活化条件为：NaOH溶液浓度为0.8mol·L-1,环氧氯丙烷体积分数为20%,NaBH4的浓度为3.0g.L-1,活化温度为40℃,活化时间为4h。以活化的琼脂糖微球为载体,亚氨基二乙酸(IDA)为连接臂,Cu2+、Ni2+、 Zn2+为螯合金属离子,分别制备了固定化AS-Cu2+、AS-Zn2+、AS-Ni2+三种亲和介质,其配基密度分别为32.05、33.22、29.17μmol·g-1。考察三种亲和介质在pH3.0-9.0的范围内金属离子的泄露百分率,结果表明酸性环境比碱性环境更容易让金属离子泄露,三种亲和介质中AS-Cu2+最稳定性,AS-Ni2+次之,AS-Zn2+最容易泄露。分别研究了三种亲和介质AS-Cu2+-、AS-Zn2+、AS-Ni2+对LFPH-I的吸附。以LFPH-I为原料,通过对比亲和介质分离ACEI的效果,筛选了AS-Ni2+作为长蛇鲻ACEI分离的亲和介质。其最优层析条件为：0.02mol·L-1磷酸缓冲盐(pH6.8,含1.0mol·L-1NaCl)为平衡液、0.02mol·L-1磷酸缓冲盐(pH4.0,含0.5mol·L-1NaCl)为洗脱液。经AS-Ni2+富集所得组分IC50值为0.116mg·mL-1.通过测定、分析粗蛋白LFPH-I及亲和层析富集组分的氨基酸摩尔百分比的变化,发现在实验条件下,相对其它氨基酸,AS-Ni2+对Met、His、 Tyr、Pro、Ile、Leu具有更高的富集作用。采用反相高效液相色谱对AS-Ni2+富集的组分进一步分离,得到活性组分N5,经反相高效液相色谱和高效毛细管电泳检测为单一组分。经飞行时间质谱测定、解析其氨基酸序列为Arg-Tyr-Arg-Pro (RYRP),其IC50值为52μM,具有较高的活性。