论文部分内容阅读
褪黑激素(Melatonin,Mel,5-甲氧基-N-乙酰基色胺),又名褪黑素、降黑色素、松果体素、黑色紧张素,是一种小分子的脂溶性物质,由松果体主要在黑夜分泌的一种神经内分泌激素。过去认为褪黑激素的作用仅是调节生物体的生理周期性节律。近年来,随着人们对M e1研究的不断深入,逐渐发现它还具有调节生殖系统、免疫系统,抗氧化、抗肿瘤等重要的生理、药理作用。而褪黑激素受体(MTNR1A)是褪黑激素发挥生物学功能的必需受体之一。本研究构建了蓝狐脾脏cDNA文库,由文库筛选获得了MTNR1A的阳性克隆,主要研究结果如下:1. cDNA文库的构建用Trizol试剂提取蓝狐脾脏总RNA,所提取的RNA质量满足文库构建的要求。cDNA文库的构建采用SMARTTM cDNA文库构建试剂盒:利用MMLV反转录酶把总RNA反转录成单链cDNA,LD-PCR方法合成双链cDNA;PCR产物经蛋白酶K水解、纯化后,用SfiI酶切;将酶切产物进行分级分离,回收400bp以上的cDNA组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生原始文库;鉴定文库的滴度和重组效率后,进行文库扩增。随机挑取10个噬菌斑,用载体克隆位点两端的通用引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。经测定原始文库滴度达到3.0×106pfu/ml,文库的重组率达到了90%,通过随机PCR检测,扩增出的片断主要集中在0.6～1.8kb,平均插入片段长度约为1.2 kb。这些数据表明,已获得高质量的蓝狐脾脏cDNA文库。构建的蓝狐脾脏的cDNA文库为进一步筛选、克隆脾脏特异表达基因奠定了基础。2. MTNR1A的克隆根据已知的蓝狐MTNR1A基因部分序列和狗的MTNR1A基因序列,借助Primer5.0引物设计软件,结合PCR引物设计优化条件,设计、合成引物。用基于PCR的96孔板筛选方法从蓝狐脾脏cDNA文库中分离获得阳性克隆,其序列与已知的蓝狐MTNR1A基因部分序列有100%的同源性,与已报道的狗、马、猕猴等动物的MTNR1A的cDNA分别有98%、88%、85%以上的同源性,推测该cDNA为MTNR1A的cDNA。蓝狐MTNR1A cDNA的获得,为进一步研究Mel配体-受体间的相互作用和生物功能提供了重要条件。