水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组成员。RBSDV由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式传毒。RBSDV侵染的水稻植株表现出植株矮缩、分蘖增多、叶色浓绿、沿茎和叶脉出现瘤状突起等明显的症状。RBSDV基因组由10条双链RNA(dsRNA)组成,根据其在聚丙烯酰胺凝胶上的迁移率依次命名为S1-S10。序列分析表明,第5条基因组(S5)包含两个部分重叠的开放阅读框(ORF),分别编码两个蛋白p5a和p5b,但S5的编码方式以及p5a和p5b在病毒与植物互作中的作用都尚未清楚。在本研究中,利用本实验室制备p5a和p5b的多克隆抗体对感病水稻进行检测分析。Western-blot分析表明S5编码两个蛋白的大小分别为106kDa和27kDa,与序列分析的结果相符。利用的p5a和p5b的多克隆抗体对感病水稻植株分别进行标记,免疫电镜观察分析显示p5a抗体的免疫胶体金颗粒可特异性地标记在病株水稻体内的病毒基质(Viroplasm)中,推测p5a是病毒基质的成份之一,参与病毒基质的形成。Northern-blot结果显示S5基因组在转录的过程中不产生亚基因组,据此推测该基因组为双顺反子的编码方式。为了进一步确认p5a参与病毒基质的形成过程,利用酵母双杂交的方法对p5a与RBSDV病毒基质形成的重要蛋白基因组S6编码的p6进行互作分析。结果显示p5a与p6存在明显的互作关系。双分子荧光互补实验(bimolecular fluorescencecomplement, BIFC)试验也证明该两个蛋白在植物细胞内存在明显互作。利用p5a、p6在感病水稻中亚细胞共定位分析表明,该两个蛋白可特异性地标记在病毒基质上。因此,推测p5a通过与p6互作的方式参与病毒基质的形成过程。利用本实验室构建的水稻酵母cDNA文库,对p5a进行筛库分析试验。对筛选出的蛋白进行回转验证后,共获得13个互作的水稻寄主因子,其中4个寄主因子在酵母中与p5a存在明显互作。序列分析显示这些筛选到的寄主因子是参与植物光合作用、呼吸作用和其他一些重要生命代谢途径,暗示p5a可能通过与这些关键寄主因子的互作参与植物或病毒的生命代谢发展过程。为了进一步分析p5b的功能,对筛选出的一个寄主因子OsRCA-2进行系统分析。亚细胞定位分析表明p5b在细胞质、细胞核和植物的叶绿体细胞中都有分布,OsRCA-2基因主要分布于植物的叶绿体中,该结果支持p5b与OsRCA-2存在互作的结论。另外,免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation, CO-IP)也表明p5b与OsRCA-2在细胞内存在互作。利用RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)对OsRCA-2在烟草中的同源基因NbRCA-2进行基因沉默,NbRCA-2基因沉默后的烟草植株表现出矮缩症状,且其矮缩的程度与该基因的沉默率呈正相关。然后,对p5b在NbRCA-2沉默的烟草植株中进行亚细胞定位分析,结果显示p5b不能定位于叶绿体细胞内,表明p5b可能是通过与RCA-2的互作进入植物叶绿体细胞中并影响植物叶绿体的功能,从而导致植株出现矮缩的症状。据此,推测p5b可能为RBSDV的致病因子。