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[研究背景]肺癌是当今世界上严重威胁人类健康和生命的肺部最常见的恶性肿瘤,其中约85%为非小细胞肺癌(NSCLC).化疗是目前肿瘤主要治疗手段之一。阿霉素(Doxorubicin, DOX)是目前临床常用的蒽环类抗肿瘤药物,然而该类药物毒性较大,长期应用可发生剂量依赖性的不可逆的心肌病变,骨髓抑制,脱发,消化道症状等,同时其多药耐药性的存在也使其在临床的应用受到一定限制。目前,载体给药系统,例如脂质体、纳米粒和聚合胶束等作为一种新型的MDR逆转策略被认为是最有效的途径,已经在临床上取得了可喜的进展。作为载体给药系统的一员,从两亲性嵌段共聚物发展而来聚合物胶束,近十年来深受青睐。当投入到水性介质中时,在体系自由能降低的驱动下,胶束的疏水段自发聚集在一起形成微粒的内核。它既可以作为很多难溶性药物的微储库,又能避免药物在生物体内环境中失活。自组装形成的载药胶束是热力学、动力学稳定的体系,具有稳定、长效、安全等许多优良的性质,使得聚合物胶束成为难溶性药物理想的输送系统,且在药物释放、基因载体和诊断制剂等很多方面得到广泛地应用。[研究目的]本课题以聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG),聚己酸内酯(polycaprolactone,PCL)和普朗尼克P105为高分子材料,采用溶剂挥发法制备阿霉素载药胶束,并对阿霉素载药胶束的体外抗肿瘤活性进行研究。[研究方法]1.采用三种不同的高分子聚合物,聚乙二醇,聚己酸内酯和普朗尼克P105,阿霉素为模型药物,溶剂挥发法制备阿霉素载药胶束及空白胶束。共聚物胶束在水中的粒径分布采用动态光散射粒径测定仪(DLS)进行测定。共聚物胶束的形态通过透射电镜(TEM)观察,HPLC法测定阿霉素载药胶束中阿霉素的含量。2.溴化四氮唑蓝(MTT)法测定阿霉素和阿霉素载药胶束对肺癌细胞系A549的抑制作用,并通过绘制细胞生长抑制曲线,来判别细胞毒作用的强弱。3.阿霉素具有荧光性,我们利用流式细胞术和激光共聚焦研究A549细胞对阿霉素和阿霉素载药胶束的摄取和滞留。4.细胞吸收阿霉素载药胶束后,为了更精确观察药物在细胞内的分布,我们分别用Hoechst33342, MitoTracker Deep Red FM及LysoTracker Blue DND-22对细胞核、线粒体、溶酶体进行染色,采用激光共聚焦显微镜分析阿霉素载药胶束的细胞核及亚细胞结构的靶向分布。5.通过克隆形成实验评价阿霉素载药胶束较阿霉素的放疗增敏效应。[研究结果]1.透射电镜观察结果显示,阿霉素载药胶束及空载体胶束,粒子呈球型,颗粒状,无粘连。胶束的粒径多在100-200nm。高效液相色谱法(high performance liquid chromatograph, HPLC)测得样本在1.11-111μg/ml浓度范围内线性关系良好,从而测出阿霉素载药胶束中药物浓度。2.阿霉素载药胶束的抗肿瘤活性比普通阿霉素明显增强。空白PEG-PCL/P105聚合物胶束对细胞几乎没有毒性,说明阿霉素载药胶束是通过阿霉素,而并非药物载体起到抗肿瘤的作用。3.流式及激光共聚焦检测细胞对药物的摄取及滞留。结果显示在阿霉素药物浓度相同时,相同作用时间下,阿霉素载药胶束比普通阿霉素更容易被细胞摄取,阿霉素载药胶束在细胞内滞留时间明显延长。4.阿霉素载药胶束和普通阿霉素的亚细胞定位大致相同。药物的红色荧光和LysoTracker Blue DND-22染色剂的荧光信号部分重叠,和MitoTracker Deep Red FM染色剂的荧光信号完全重叠,和Hoechst33342染色的荧光信号不重叠。实验结果证明细胞吸收阿霉素载药胶束或者阿霉素后,可以通过溶酶体途径转运。5.与单纯放疗组相比,普通阿霉素或阿霉素载药胶束联合放疗组细胞生存曲线斜率更低。因此,阿霉素与阿霉素载药胶束都具有放疗增敏作用。同时,与放疗联合普通阿霉素组相比,放疗联合阿霉素载药胶束组对肿瘤细胞的放疗增敏效应更强。[结论]我们采用三种不同的高分子聚合物,聚乙二醇(PEG),聚己酸内酯(PCL)和普朗尼克P105,阿霉素为模型药物,制备合成了阿霉素载药胶束。通过细胞实验验证所制备的纳米胶束给药系统的体外抗肿瘤活性。MTT结果证明阿霉素载药胶束的抗肿瘤活性比普通阿霉素明显增强而且空白PEG-PCL/P105聚合物胶束对细胞几乎没有毒性；流式细胞仪及激光共聚焦结果均表明阿霉素载药胶束较普通阿霉素更易被细胞摄取,在细胞内滞留时间延长；采用激光共聚焦手段测定阿霉素及阿霉素载药胶束亚细胞器定位,结果证明阿霉素载药胶束与溶酶体是部分共定位,与线粒体是共定位的,但没有与细胞核共定位；阿霉素载药胶束还具有比普通阿霉素更强的放疗增敏效应。