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急性胰腺炎(acutepancreatitis,AP)是内科常见急腹症之一,是一种由胆石、酒精、高甘油三酯等因素导致的突发性胰腺外分泌炎症性疾病,可诱发全身炎症反应,造成胰腺外远隔器官功能损伤。AP年发病率为40-70例/10万人,大部分患者表现为急性间质水肿性胰腺炎,即轻型急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP),临床仅表现为胰腺局部水肿渗出;但仍存有约10-20%AP患者因不可控制的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和/或胰腺坏死组织感染(infected pancreatic necrosis,IPN)发展为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP),常并发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)、急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)、急性肝功能衰竭(acute hepatic failure,AHF)等多器官功能障碍(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),死亡率可达10-40%。SAP患者通常会经历两个死亡高峰,早期的死亡高峰多由于SIRS及其导致的MODS所致,而晚期的死亡高峰多由于IPN、脓毒血症以及其合并的MODS导致。近年来我国高甘油三酯血症急性胰腺炎(hypertriglyceridemic acute pancreatitis,HTG-AP)发病率逐年增加,高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia,HTG)已成为我国AP的第二大病因。临床研究提示AP严重程度与血甘油三酯(triglyceride,TG)水平呈正相关,HTG-AP患者MODS发病率显著高于胆源性胰腺炎,且HTG是HTG-AP并发ALI、AKI等并发症的独立危险因素。肺脏是AP远隔脏器损伤中最易累及的器官,40-70%SAP患者可并发ALI,死亡率高达60%,因此阐明AP相关肺损伤的发病机制可为临床SAP防治策略提供重要的基础理论依据。目前关于HTG加重AP相关肺损伤的机制尚不明确。最新研究显示NLRP3炎症小体通路在ALI中具有重要作用,而脂质代谢产物游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)可激活NLRP3通路。鉴于此,我们提出本课题假说:TG脂解产生的FFA通过激活NLRP3炎症小体通路加重HTG-AP相关肺损伤。目前已报道多种HTG-AP动物模型,例如脂蛋白酯酶基因敲除(lipoprotein lipase knockout,LPL-/-)小鼠、载脂蛋白 C3 转基因(apolipoprotein C3 transgenic,Apo-C3 Tg)小鼠、高脂喂饲的仓鼠等,但均存在不同程度的缺陷而限制其应用。因此,迫切需要建立新型的HTG-AP动物模型。本课题通过泊洛沙姆407(poloxamer407,P-407)联合雨蛙素(caerulein,Cae)诱导建立了一种新型HTG-AP小鼠模型。进而使用P-407诱导的、GPIHBP1基因敲除(GPIHBP1 knockout,GPIHBP1-/-)的两种严重高甘油三脂(severe hypertriglyceridemia,SHTG)小鼠模型,观察SHTG对于AP相关ALI模型及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导ALI模型小鼠肺损伤的作用,并尝试从NLRP3炎症小体通路解释其机制。本论文分为两个部分:第一部分 一种新型高甘油三酯血症急性胰腺炎小鼠模型的建立研究目的:近年来HTG-AP发病率及死亡率逐年增高,但缺乏理想的动物模型。本研究目的在于建立一种新型HTG-AP小鼠模型。研究方法:选用6-8周龄C57BL/6小鼠为实验对象,随机分为四组:PBS组、P-407组、PBS+Cae组及P-407+Cae组。腹腔注射P-407建立SHTG模型,腹腔注射Cae诱导小鼠AP,12小时后麻醉处死小鼠,留取血清、胰腺等组织样本。比较不同HTG持续时间与不同HTG严重程度对小鼠AP的影响。最后使用极低剂量Cae(5μg/kg)干预SHTG小鼠(P-407组)及对照PBS组小鼠,探究SHTG对小鼠AP易感性的作用,并使用流式细胞术检测胰腺组织内免疫细胞分布状态。研究结果:P-407诱导的小鼠血TG水平呈药物剂量依赖性,高剂量P-407(0.5g/kg)诱导小鼠血TG水平可稳定于5000mg/dl以上。常规剂量Cae(50μg/kg)诱导的HTG-AP小鼠(P-407+Cae组)胰腺及肺脏病理损伤明显重于对照组(PBS+Cae组)。HTG-AP严重程度与血HTG水平及持续时间呈正相关。极低剂量Cae(5μg/kg)不能诱导正常小鼠(PBS组)胰腺病理损伤,但可造成SHTG小鼠胰腺组织炎性细胞浸润、水肿等病理改变。最后,我们通过流式细胞术检测发现SHTG可导致小鼠胰腺组织内CD45+F4/80+及CD45+Gr-1+细胞增加。结论:我们使用P-407联合Cae建立了一种新型的HTG-AP小鼠模型。该模型稳定可控,较好模拟了 HTG-AP患者的病理生理特点及临床特征。第二部分 严重高甘油三酯加重急性胰腺炎相关肺损伤的作用及机制研究研究目的:本研究在前期建立HTG-AP模型的基础上,明确SHTG对小鼠AP相关肺损伤的作用,并探索其机制。研究方法:应用P-407诱导的SHTG小鼠、GPIHBP1-/-的SHTG小鼠及相关对照组为实验动物,腹腔注射Cae(50μg/kg)诱导AP相关ALI模型或腹腔注射LPS(5mg/kg)诱导小鼠ALI模型。留取血清、肺泡灌洗液、胰腺及肺脏组织等进行后续实验。应用人肺上皮细胞株A549进行体外实验,LPS(20μg/ml)建立体外肺上皮细胞损伤模型,油酸(oleic acid,OA)干预细胞观察FFA在细胞损伤中的作用,并进一步应用NLRP3特异性抑制剂MCC950探讨相关机制。研究结果:1.在两种SHTG小鼠中均观察到SHTG加重小鼠AP胰腺损伤,致使胰腺组织水肿、坏死、炎症细胞浸润显著增加,血清炎性细胞因子水平(TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6)水平升高。雨蛙素诱发小鼠AP相关ALI后,SHTG小鼠(P-407组或GPIHBP1-/-组)肺组织损伤、肺泡灌洗液促炎因子水平(TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6)均高于对照组小鼠(PBS组或WT组),MPO及CD68免疫组织化学染色可观察到SHTG小鼠肺组织表达显著高于对照小鼠。2.给予正常小鼠及SHTG小鼠等量炎症刺激(5mg/kg LPS),仍可观察到SHTG小鼠(P-407组或GPIHBP1-/-组)肺组织损伤、肺泡灌洗液促炎因子水平(TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-6)高于对照组小鼠(PBS 组或 WT 组),MPO 及CD68免疫组织化学染色观察到SHTG小鼠肺组织表达显著高于对照小鼠。3.体内试验中ALI小鼠肺组织NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β mRNA及蛋白表达均显著升高,且SHTG小鼠肺组织表达水平显著高于对照组小鼠。体外实验显示,OA不能单独导致肺上皮细胞损伤,但可加重LPS诱导的细胞损伤,且NLRP3,ASC,Caspase-1与IL-1β mRNA及蛋白水平升高。使用NLRP3特异性抑制剂MCC950可抵消OA加重LPS诱导的细胞损伤作用。结论:SHTG通过加重胰腺组织损伤间接加重AP相关ALI,也可通过激活NLRP3炎症小体通路直接加重AP相关ALI。