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一、目的:基于miR-204对PI3K/Akt/Runx2通路的调控作用,利用MC3T3-E1细胞进行体外实验,观察三七总皂苷对成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及功能情况的影响,研究三七总皂苷的作用机制。二、方法:体外培养小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1,分为四组,即对照组,加入不同浓度的三七总皂苷的处理组,使培养基中三七总皂苷的浓度梯度分别为0、10、20、50mg/L,培养14天后,使用倒置相差显微镜下观察每组中MC3T3-E1细胞的形态。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清液中骨钙素和碱性磷酸酶的表达情况,MTT法测定三七总皂苷对MC3T3-E1细胞的增殖影响,流式细胞术测定三七总皂苷对MC3T3-E1细胞凋亡的影响。RT-PCR及Western Blot法测定各组中Ⅰ型胶原COL1A1,骨桥蛋白(Ostepontin,OPN),骨钙蛋白(Bone Gla Protein,BGP)的mRNA及蛋白水平的表达情况。之后,RT-PCR法检测各组中miR-204,PI3K,Akt,BCL-2和Runx2的表达水平,Western Blot法测定各组中BCL-2,Bax,.Runx2,及磷酸化PI3K和Akt的表达情况。三、结果:1.三七总皂苷在体外培养促进MC3T3-E1成骨细胞增殖和分化1.1细胞形态10、20、50mg/L的三七总皂苷对MC3T3-E1细胞形态并无产生显著的影响。1.2细胞增殖经过24,48,72小时与对照组相比,20及50mg/L三七总皂苷组的细胞增殖明显提升(P<0.05),其对MC3T3-E1细胞增殖的促进作用随着浓度的增加而增强,差异具有统计学意义。而10mg/L处理组在中细胞的增殖情况与对照组相比并无差别。1.3细胞凋亡经过48小时三七总皂苷的刺激培养后,20及50mg/L处理组中细胞的凋亡明显下降(P<0.05),与对照组相比差异具有统计学意义。50mg/L处理组中细胞的凋亡也显著低于20mg/L处理组。而10mg/L处理组在中细胞的凋亡情况与对照组相比并无差别。1.4骨钙素和碱性磷酸酶水平与对照组相比,经过48小时10、20、50mg/L三七总皂苷的培养后,20及50mg/L处理组中细胞培养上清液中骨钙素和碱性磷酸酶水平明显升高(P<0.05),差异具有统计学意义。50mg/L处理组中骨钙素和碱性磷酸酶水平也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组在中细胞的凋亡情况与对照组相比并无差别。1.5成骨标志基因COL1A1,OPN,BGP mRNA表达水平与对照组相比,经过48小时10、20、50mg/L三七总皂苷的培养后,20及50mg/L处理组中细胞COL1A1,OPN及BGP mRNA水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L组中COL1A1,OPN及BGP的表达水平也显著高于20mg/L组。10mg/L处理组在中细胞COL1A1,OPN及BGP水平情况与对照组相比均略有升高,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。1.6成骨标志基因COL1A1,OPN,BGP蛋白表达水平与对照组相比,经过48小时10、20、50mg/L三七总皂苷的培养后,20及50mg/L处理组中细胞COL1A1,OPN及BGP蛋白表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),50mg/L处理组中COL1A1,OPN及BGP的蛋白表达水平也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组中细胞COL1A1,OPN及BGP水平情况与对照组相比均略有升高,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。2.三七总皂苷抑制MC3T3-E1成骨细胞中miR-204的表达促进MC3T3-E1成骨细胞的增殖和分化2.1 BCL-2及Bax mRNA水平表达经过48小时10、20、50mg/L与对照组相比,在mRNA表达水平上,20及50mg/L处理组中BCL-2显著升高,Bax的显著降低,其差异均具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L处理组中BCL-2及Bax mRNA表达水平的改变幅度也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组中BCL-2 mRNA表达水平较对照组相比也均略有升高,Bax的mRNA表达水平也略有下降低,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。2.2BCL-2及Bax蛋白水平表达经过48小时10、20、50mg/L与对照组相比,在蛋白表达水平上,20及50mg/L处理组中BCL-2显著升高,而Bax显著降低,差异均具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L处理组中BCL-2及Bax蛋白表达水平的改变幅度也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组中BCL-2蛋白表达水平较对照组相比也均略有升高,Bax的蛋白表达水平也略有下降低,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。2.3miR-204表达经过48小时10、20、50mg/L与对照组相比,20及50mg/L处理组中miR-204表达水平均显著降低,其差异均具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L处理组中miR-204的表达水平也显著低于20mg/L处理组。而10mg/L处理组中miR-204表达水平较对照组相比也均略有下降,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。2.4增强miR-204表达后,三七总皂苷对MC3T3-E1细胞成骨能力下降 经过48小时50mg/L三七总皂苷的刺激培养后,与未转染miR-204对照组相比,miR-204高表达的细胞培养上清液中骨钙素和碱性磷酸酶水平明显降低(P<0.05),PCR结果显示,其细胞中BGP,CoL1A1及OPN水平均显著下降(P<0.05),其差异具有统计学意义。2.5信号通路分子PI3K,Akt及Runx2 mRNA水平表达经过48小时10、20、50mg/L与对照组相比,10、20、50mg/L处理组中PI3K及Akt在mRNA层面表达水平并无显著差异(P>0.05),而20mg/L及50mg/L处理组中细胞Runx2mRNA水平显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L处理组中Runx2的表达水平也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组在中细胞Runx2mRNA水平的表达情况与对照组相比均略有升高,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。2.6.PI3K,Akt蛋白磷酸化的影响及其对Runx2蛋白表达水平经过半小时10、20、50mg/L与对照组相比,20及50mg/L处理组中p-PI3K,p-Akt显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L处理组中p-PI3K,p-Akt也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组中p-PI3K,p-Akt与对照组相比均略有升高,但其差异并无统计学意义(P>>0.05)。经过48小时10、20、50mg/L与对照组相比,20及50mg/L处理组中细胞Runx2蛋白水平显著升高,其差异具有统计学意义(P<0.05),而50mg/L处理组中Runx2的表达水平也显著高于20mg/L处理组。而10mg/L处理组中Runx2水平情况与对照组相比均略有升高,但其差异并无统计学意义(P>0.05)。四、结论:三七总皂苷可以通过抑制成骨细胞中miR-204激活PI3K/Akt/Runx2通路促进成骨细胞增殖和分化。