克罗诺杆菌(Cronobacter spp.)寄生于人体和动物肠道内,是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。研究表明,污染该菌的婴幼儿配方奶粉能引起婴幼儿坏死性小肠结肠炎、败血症、脑膜炎等疾病,并且可引起神经系统后遗症或迅速死亡,死亡率高达40-80%。然而,食品中Cronobacter spp.的污染来源、传播模型及该菌抵御酸胁迫的分子机制尚不清晰。本论文从全国蔬菜食品中Cronobacter spp.的污染调查和风险识别出发,结合API20E、药敏试验、肠杆菌基因间重复共有序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)分型技术、分子血清型、多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)和基因组测序技术对分离株进行表型和基因型特征的全面分析。在此基础上,从食源性Cronobacter spp.分离株中筛选出耐酸优势菌株,通过转录组与蛋白组分析该菌株在酸胁迫下基因与蛋白质的表达差异,并对候选因子进行耐酸过程的生物学特性研究,探索阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)耐酸的分子基础及调控机制。本论文的主要内容和研究结果如下:1、从全国39个城市采集403份蔬菜食品,共检出122份Cronobacter spp.的阳性样品,污染率为30.27%。在7个地理分区中,南部地区的污染率最高(35.21%),其中16.39%的Cronobacter spp.阳性样品污染水平大于110 MPN/g,11.48%的阳性样品污染水平处于10≤MPN<110。耐药性结果表明,59.77%Cronobacter spp.分离株对头孢噻吩具有耐药性,其中有两株菌株呈现多重耐药性。基于分子血清型发现,C.sakazakii O1血清型为该菌种的优势血清型(23.98%)。ERIC-PCR和MLST分型结果揭示蔬菜分离株具有丰富的遗传多样性,本研究发现55个新的ST型别,并鉴定到15种临床相关的ST型,ST60为其优势ST型(8株)。2、采用RNA Sequencing(RNA-seq)和同位素标记相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术分别构建C.sakazakii在pH 3.6、pH 4.5及pH 5.5酸胁迫条件下的转录表达谱和蛋白表达谱。在pH 5.5的酸处理下C.sakazakii菌株有181个差异表达基因(4.40%),其中表达上调的基因76个,表达下降的基因105个;在pH 4.5酸处理下菌株有946个差异表达基因(23.20%),其中248个表达上调,698个表达下降;经过pH 3.6处理后菌株有717个差异表达基因(17.34%),其中439个表达上调,278个表达下调。转录组学数据表明,当C.sakazakii暴露在酸胁迫环境中菌体自身鞭毛、氨基酸合成与代谢、糖代谢及脂肪酸代谢等生理活动对其耐酸过程扮演着重要的角色。蛋白组数据则显示,在pH 5.5处理下,差异表达的蛋白为164个(5.49%),其中上调蛋白79个,下调蛋白85个;在pH 4.5处理下,差异表达蛋白为322个(10.77%),其中上调蛋白150个,下调蛋白172个;在pH 3.6处理下,差异表达蛋白为770个(25.76%),其中上调蛋白439个,下调蛋白278个。C.sakazakii在酸胁迫下细菌趋化性、鞭毛组装、糖代谢途径、氨基酸相关途径的蛋白水平变化较大。由此可见,转录组和蛋白组的差异表达结果在GO、KO等功能富集方面保持很好的一致性。3、权重共表达网络分析(weighted correlation network analysis,WGCNA)发现,磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)及核酸合成转运两大功能通路与该菌的酸胁迫应答具有强相关性。利用qPCR技术对23个候选基因进行验证,并对qPCR结果与其对应的RNA-Seq数据进行比较。结果显示,果糖-PTS操纵子fruKBA的同源基因1324、1325、1326表达量较高。因此,我们构建C.sakazakii果糖-PTS操纵子1324、1325、1326基因敲除及其回补菌株,并对其进行耐酸能力比较。结果发现,1325基因可能对C.sakazakii的耐酸过程发挥更加重要的作用;而1324基因只有在pH 3.6时有助于其耐酸过程,并在pH 5.5和pH 4.5弱酸处理下可能存在负调控的现象。4、根据课题组前期研究,将候选基因grxB进行了敲除,并探究其表型及耐酸性差异。结果表明,与C.sakazakii野生型菌株相比,ΔgrxB菌株在酸性条件下的存活率更低,生物量受损更严重,细胞内ATP泄漏更多,表明grxB参与了C.sakazakii耐酸响应过程。这可能是由于grxB作为Grx系统的重要组成部分,可通过谷胱甘肽代谢途径消耗质子,从而提高其耐酸性;且GrxB作为维持胞内的氧化还原态势体系的重要蛋白,其在C.sakazakii细胞在耐酸过程中的积极响应可能与其对酸-氧化胁迫的交叉保护作用有关。grxB在CSH、自凝集和生物膜的形成起着重要的正调节作用,揭示了grxB在C.sakazakii的粘附、聚集过程中的重要性。C.sakazakii酸胁迫应答与生物膜形成能力之间存在一定的相关性。综上所述,本论文基于我国蔬菜食品中Cronobacter spp.的污染情况调查,建立具有中国特色的食源性Cronobacter spp.菌种资源库及风险识别数据库;根据转录组学和蛋白质组学数据分析,从不同水平揭示逆境胁迫下Cronobacter spp.的分子差异表达情况;初步证实了果糖-PTS基因及grxB对C.sakazakii酸胁迫耐受性的作用功能。研究成果将为有效预防和控制由Cronobacter spp.造成的食源性危害提供基础数据支撑和理论数据参考。