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目的：为研究人巨细胞病毒(HCMV)基因编码蛋白的功能,拟构建融合于GAL4活性区域的HCMV Towne株全基因组随机表达文库。利用酵母双杂交技术从该文库中筛选与HCMV UL23基因编码的皮层蛋白pUL23相互作用的病毒编码蛋白。该研究为揭示pUL23在HCMV感染过程中的功能奠定了基础。方法：1)鸟枪法构建HCMV基因组表达文库：抽提HCMV Towne-BAC DNA,经DNase I随机酶切成为0.5-2.5 kb的DNA小片段群。将该DNA片段群末端平滑化后再进行加“A”反应,与pMD18T载体连接过夜进行TA克隆。转化E. coliDH5α感受态细胞,涂布棒收集阳性克隆并抽提质粒。将双酶切质粒得到的0.5-2.5 kb DNA片段群插入至pGADT7载体,转化E. coli DH5α感受态细胞,所得克隆即为pGADT7-HCMV基因组文库。2)酵母双杂交实验：将构建好的诱饵质粒pGBKT7-UL23和HCMV基因组表达文库质粒共转酵母细胞AH109,挑取克隆并经β一半乳糖苷酶活性检测。抽提阳性克隆质粒,电击转化E. coli DH5α。将所得阳性克隆质粒送测序,并对测序结果在GenBank上进行同源性搜索和序列比对分析。3)GST-pull down实验：构建原核表达质粒pGEX4T-1-UL24,并转化大肠杆菌表达菌(?)uner(DE3); IPTG诱导表达GST-UL24融合蛋白。构建pcDNA3.1(+)-Flag-UL23质粒,将其瞬时转染Cos-7细胞,表达UL23-Flag蛋白。将GST-UL24和UL23-Flag蛋白共同孵育后,用抗Flag标签抗体进行Western Blotting检测。4)免疫共沉淀实验：构建pcDNA3.1(+)-HA-UL24质粒,与pCDNA3.1(+)-Flag-UL23质粒共转染Cos-7细胞,收集细胞裂解液上清。以抗HA标签抗体进行免疫沉淀后,分别用抗HA和抗Flag标签抗体检测免疫沉淀物。结果：酵母双杂交实验从病毒文库中得到6个与病毒蛋白pUL23相互作用蛋白的阳性克隆,其中3个属于HCMV基因克隆。选择其中一个阳性克隆HCMV UL24基因,利用酵母双杂交回复性杂交实验,以及GST-pull down实验和免疫共沉淀实验进一步确证pUL24与pUL23具有相互作用。结论：构建的HCMV基因组表达文库能够用于酵母双杂交系统研究蛋白质相互作用,并成功筛选到与pUL23相互作用的病毒自身编码蛋白pUL24。该研究为揭示pUL23在HCMV感染过程中的功能奠定了基础。