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目的:观察慢性肾衰竭(chronic renal failure,CRF)湿热证患者服用清肾颗粒前后血清缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及E-钙粘连蛋白(E-cadherin)的变化情况;探讨清肾颗粒能否通过干预慢性肾脏病患者体内缺氧诱导因子HIF-1α介导Wnt/β-catenin通路的活化,以改善其肾功能,减轻临床症状。方法:依照纳入标准和随机数字表,把70例湿热证CRF患者分为两组(治疗组和对照组)各35例,并设正常组30例(用于检测血清HIF-1α、Wnt1、β-cateninα-SMA、E-cadherin)。研究最终完成68例(治疗组、对照组均为34例),因在研究期间加服百令胶囊1例,手术中途停药1例,故共剔除2例受试者。中药保留灌肠、西医基础治疗均用于两组受试者,治疗组受试者加用清肾颗粒(3次/天,10g/次,疗程为12周)。观察两组患者治疗前后血肌酐(serumcreatinine,Scr)、HIF-1α、Wnt1、β-catenin、α-SMA、E-cadherin、中医证候积分值,估算肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,e GFR),并评估两组患者的临床疾病疗效、中医证候疗效。结果:1.临床疾病疗效:治疗组、对照组总有效率分别为79.41%、64.71%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。2.中医证候疗效:治疗组、对照组总有效率分别为76.47%、58.82%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.治疗前治疗组和对照组患者中医证候积分比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗12周后,两组中医证候积分均较治疗前不同程度下降(P<0.01,P<0.05),治疗组中医证候积分显著优于同期对照组(P<0.01)。4.治疗前两组患者Scr比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗12周后,治疗组患者Scr与治疗前比较明显下降(P<0.01),与同期对照组比较明显下降(P<0.01);对照组患者治疗12周后Scr与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。5.治疗前两组患者e GFR比较差异无统计学意义(P>0.05);治疗12周后,治疗组患者e GFR与治疗前比较明显升高(P<0.01),与同期对照组比较升高明显(P<0.01);对照组患者治疗12周后e GFR与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)。6.治疗组与对照组患者治疗前血清HIF-1α、Wnt1、β-catenin、α-SMA、E-cadherin水平均显著高于正常组(P<0.01),且治疗组患者血清HIF-1α、Wnt1、β-catenin、α-SMA及E-cadherin水平与对照组比较差异无统计学意义((P>0.05);治疗组患者治疗后血清HIF-1α、Wnt1、β-catenin、α-SMA、E-cadherin水平与治疗前比较下降明显(P<0.01),且与同期对照组比较明显下降(P<0.01);对照组患者血清HIF-1α、Wnt1、β-catenin、α-SMA、E-cadherin水平较治疗前差异无统计学意义((P>0.05)。7.CRF湿热证患者治疗前血清HIF-1α水平与Wnt1、β-catenin相关性研究分析均呈正相关(P<0.01)。8.安全性观察项目分析:治疗组患者治疗12周后检测血常规、尿常规、粪常规、肝功能(主要是ALT、AST)及心电图等各项安全性指标与治疗前比较均未见明显变化。结论:1.慢性肾衰竭湿热证患者血清HIF-1α,Wnt1,β-catenin,α-SMA及E-cadherin水平均升高,且HIF-1α与Wnt1、β-catenin相关性分析提示HIF-1α与Wnt1、β-catenin均呈正相关;证实了HIF-1α介导Wnt/β-catenin信号通路活化在慢性肾衰竭的发病及病程进展中具有促进作用;2.清肾颗粒能够减轻CRF湿热证患者临床症状,降低血肌酐水平。3.HIF-1α,Wnt1,β-catenin,α-SMA及E-cadherin水平,说明清肾颗粒能够干预HIF-1α介导Wnt/β-catenin信号通路的活化;4.疗前未见明显变化,说明此药安全性良好。目的:通过检测清肾颗粒高、中、低三个剂量组对5/6肾切除所致的肾间质纤维化大鼠模型肾脏组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)、Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)、磷酸化β-连环蛋白(p-β-catenin)、轴蛋白-1(axin1)、轴蛋白-2(axin2)、E-钙黏达情况;探讨清肾颗粒各剂量组是否能通过抑制HIF-1α介导的Wnt/β-catenin通路活性减轻肾小管上皮细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程,进而发挥抗肾间质纤维化效应。方法:清肾颗粒高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予清肾颗粒水溶液按4.0g/kg·d、8.0g/kg·d和16.0g/kg·d灌胃;XAV939组将XAV939溶于二甲亚矾(DMSO)储存,浓度为10mmol/L,温度-20℃保存,实验时按照0.6ml/100g、每2天1次腹腔注射给药。正常组、假手术组及模型组均给予等量生理盐水灌胃。各组连续给药12周。检测血肌酐(serum Creatinine,Scr)、内生肌酐清除率(Creatinine Clearance,Ccr)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、24小时尿蛋白定量(24-hoururine protein,24h Upro)及尿肌酐(urine creatinine,Ucr);Western blot法检测肾脏组织中HIF-1α、Wnt1、β-catenin及p-β-catenin、axin1及axin2、E-cadherin及α-SMA蛋白表达;免疫组化法及免疫荧光法检测肾组织中的HIF-1α、Wnt1、β-catenin、p-β-catenin、E-cadherin及α-SMA的表达情况;HE染色、masson染色及PAS染色观察清肾颗粒高、中、低剂量组及XAV939组对大鼠肾脏组织病理学变化情况。结果:1.各组大鼠血Scr、BUN、24h Upro比较:假手术组大鼠血Scr、BUN、24h Upro水平与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组血Scr、BUN、24h Upro水平与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组、XAV939组大鼠血Scr、BUN、24h Upro水平与模型组大鼠比较均有所下降(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组大鼠Scr、BUN、24h Upro水平最低;清肾颗粒高剂量组大鼠Scr、BUN、24h Upro水平较XAV939组明显下降(P<0.01)。2.各组大鼠Ccr比较:假手术组大鼠Ccr水平与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组Ccr水平与正常组及假手术组比较明显下降(P<0.01);清肾颗粒各剂量组、XAV939组大鼠Ccr水平与模型组大鼠比较均有所升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组大鼠Ccr水平最高;清肾颗粒高剂量组大鼠Ccr水平较XAV939组明显升高(P<0.01)。2.各组大鼠HIF-1α、Wnt1、β-catenin、p-β-catenin、axin1、axin2、E-cadherin及α-SMA蛋白表达情况(Western blot法):⑴HIF-1α蛋白表达情况比较:假手术组大鼠HIF-1α表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠HIF-1α蛋白表达与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);模型组比较,清肾颗粒高、中、低剂量组大鼠HIF-1α蛋白下降明显(P<0.01);清肾颗粒高、中、低剂量组比较,高剂量组的HIF-1α蛋白表达最低;XAV939组大鼠HIF-1α蛋白表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);清肾颗粒高剂量组HIF-1α蛋白表达与XAV939组比较下降明显(P<0.01)。⑵Wnt1蛋白表达情况比较:假手术组大鼠Wnt1蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠Wnt1蛋白表达与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠Wnt1蛋白表达下降明显(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组的Wnt1蛋白含量最低;清肾颗粒高剂量组Wnt1蛋白含量与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑶β-catenin蛋白表达情况比较:假手术组大鼠β-catenin蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠β-catenin蛋白表达与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠β-catenin蛋白表达降低(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组β-catenin蛋白含量最低;清肾颗粒高剂量组β-catenin蛋白表达与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑷p-β-catenin蛋白表达情况比较:假手术组大鼠p-β-catenin蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠p-β-catenin蛋白表达与正常组及假手术组比较明显下降(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠p-β-catenin蛋白表达升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组的p-β-catenin蛋白含量最高;清肾颗粒高剂量组p-β-catenin蛋白表达与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑸axin1、axin2蛋白表达情况比较(Western blot法):假手术组大鼠axin1、axin2蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠axin1、axin2表达与正常组及假手术组比较明显下降(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠axin1、axin2蛋白水平升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组的axin1、axin2蛋白含量最高;清肾颗粒高剂量组axin1、axin2蛋白表达升高与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑺比较下降明显(P<0.01)。3.各组大鼠HIF-1α、Wnt1、β-catenin、p-β-catenin、E-cadherin及α-SMA蛋白表达情况(免疫组化法):⑴HIF-1α蛋白表达情况比较:假手术组大鼠HIF-1α表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠HIF-1α蛋白表达与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);模型组比较,清肾颗粒高、中、低剂量组大鼠HIF-1α蛋白下降明显(P<0.01);清肾颗粒高、中、低剂量组比较,高剂量组的HIF-1α蛋白表达最低;XAV939组大鼠HIF-1α蛋白表达与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05);清肾颗粒高剂量组HIF-1α蛋白表达与XAV939组比较下降明显(P<0.01)。⑵Wnt1蛋白表达情况比较:假手术组大鼠Wnt1蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠Wnt1蛋白表达与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠Wnt1蛋白表达下降明显(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组的Wnt1蛋白含量最低;清肾颗粒高剂量组Wnt1蛋白含量与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑶β-catenin蛋白表达情况比较:假手术组大鼠β-catenin蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠β-catenin蛋白表达与正常组及假手术组比较明显升高(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠β-catenin蛋白表达降低(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组β-catenin蛋白含量最低;清肾颗粒高剂量组β-catenin蛋白表达与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑷p-β-catenin蛋白表达情况比较:假手术组大鼠p-β-catenin蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组大鼠p-β-catenin蛋白表达与正常组及假手术组比较明显下降(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠p-β-catenin蛋白表达升高(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组的p-β-catenin蛋白含量最高;清肾颗粒高剂量组p-β-catenin蛋白表达与XAV939组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。⑸E-cadherin蛋白表达情况比较:假手术组大鼠E-cadherin蛋白表达与正常组比较差异无统计学意义P>0.05);模型组的E-cadherin蛋白表达与正常组、假手术组比较显著降低(P<0.01);与模型组比较,清肾颗粒各剂量组、XAV939组的E-cadherin表达量增强(P<0.01);清肾颗粒各剂量组比较,高剂量组E-cadherin蛋白表达最强,清肾颗粒高剂量组E-cadherin蛋白表达较XAV939组明显升高(P<0.01)。⑹(P<0.01)。4.各组大鼠HIF-1α、Wnt1、β-catenin、p-β-catenin、E-cadherin及α-SMA蛋白表达情况(免疫荧光法):⑴HIF-1α免疫荧光结果显示:HIF-1α在正常组、假手术组几乎没有表达,仅微量红色荧光;模型组、XAV939组可见明亮的红色荧光;清肾颗粒各剂量组则可见HIF-1α表达较模型组表达下降,红色荧光减弱。⑵Wnt1免疫荧光结果显示:Wnt1在正常组、假手术组几乎没有表达,仅微量红色荧光;模型组可见明亮的红色荧光;XAV939组、清肾颗粒各剂量组则可见Wnt1表达较模型组表达不同下降,红色荧光较模型组减弱。⑶β-catenin免疫荧光结果显示:β-catenin在正常组、假手术组几乎没有表达,仅微量红色荧光;模型组可见明亮的红色荧光;XAV939组、清肾颗粒各剂量组则可见β-catenin表达较模型组表达不同下降,红色荧光较模型组减弱。⑷p-β-catenin免疫荧光结果显示:p-β-catenin在正常组、假手术组可见明亮红色荧光;模型组少量表达,仅见微弱红色荧光;XAV939组、清肾颗粒各剂量组则可见p-β-catenin表达较模型组表达不同升高,红色荧光较模型组增强。⑸α-SMA免疫荧光结果显示:α-SMA在正常组、假手术组可见少量表达,仅见微弱红色荧光;模型组可见大量表达,可见明亮红色荧光;XAV939组、清肾颗粒各剂量组则可见α-SMA表达较模型组表达不同下降,红色荧光较模型组减弱。⑹E-cadherin免疫荧光结果显示:E-cadherin在正常组、假手术组可见大量表达,可见明亮红色荧光;模型组可见少量表达,仅见微弱红色荧光;XAV939组、清肾颗粒各剂量组则可见E-cadherin表达较模型组表达不同上升,红色荧光较模型组增强。5.模型组大鼠肾组织HIF-1α蛋白表达与Wnt1、β-catenin蛋白表达相关性研究分析均呈正相关(P<0.01)。6.各组大鼠肾脏病理形态学变化:正常组及假手术组大鼠肾脏的病理结构未见明显异常;模型组大鼠肾脏病理显示肾小管管腔明显扩张,肾小管上皮细胞脱落、空泡变性,肾间质大量炎性细胞浸润且蓝染胶原纤维沉积明显,肾间质损伤指数明显升高。与模型组比较,清肾颗粒各剂量组及XAV939组大鼠上述病理改变明显减轻。XAV939病变介于清肾颗粒中剂量组与清肾颗粒低剂量组之间。结论:1.HIF-1α介导Wnt/β-catenin信号通道活化参与5/6肾切除模型大鼠肾间质纤维化的形成过程;2.清肾颗粒能够降低5/6肾切除模型大鼠的血Scr、BUN及减少24h尿蛋白定量,升高Ccr;3.到延缓肾间质纤维化的作用;4.清肾颗粒可通过抑制HIF-1α介导Wnt/β-catenin信号通道活化,减少5/6肾切除模型大鼠肾组织中HIF-1α、Wnt1、β-catenin的蛋白表达,增加p-β-catenin、axin1、axin2蛋白表达,并通过下调α-SMA表达,上调E-cadherin的表达,从而抑制5/6肾切除模型大鼠肾小管EMT,延缓肾间质纤维化的进展。