连翘药材为木犀科植物连翘Forsythia suspense(Thunb)Vahl的干燥果实,是我国常用的大宗药材和多种中成药的原料,具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多种药理作用。连翘药材来源以野生为主,生长环境、品种、气候等的差异以及采收的随意性,是连翘药材质量存在巨大差异的主要原因。连翘生物学特性存在长短花柱问题,是否会影响药材质量值得深入研究。近年来连翘市场需求日益增长,连翘花、叶等新资源的开发利用具有重要的发展前景,但缺乏系统研究。因此,连翘资源和质量已成为限制连翘产业发展和医药应用的主要因素。本研究正是基于这样一些问题,立足山东连翘资源,基于对连翘形态性状的调查分析、次生代谢产物的变化规律以及多种化学成分的提取、定量分析和化学指纹图谱分析,对连翘花、叶和果开展以药用价值为核心的药物资源评价和种质资源评价,对连翘新资源的开发利用、药物资源的化学分类以及优良种质筛选具有重要的理论意义和实践指导价值。主要结果如下。1.研究了微波辅助提取(MAE)和超声波辅助提取(UAE)对连翘成分提取的影响,建立了化学成分快速提取方法。(1)溶剂的选择对MAE和UAE是关键参数之一,由于提取机制的差异,在MAE中40-60%的乙醇和50-80%的甲醇较适合所有成分的提取,在UAE中50-70%的甲醇或乙醇较适合各成分的提取。(2)提取温度对MAE的提取效率有显著影响,70℃时各成分的提取率最高;在UAE中30℃以上时温度对多数成分的提取影响较小,可以选择较低温度。(3)溶剂量对MAE和UAE的提取有显著影响,在MAE中30 m L/g的溶剂量对于各成分即可获得最佳提取效,在UAE中,溶剂量20 mL/g以上时再增加溶剂量对提取效率已无显著影响。(4)微波功率对MAE中各成分的提取率影响较小,400 W时即可获得最佳提取效果;在UAE中随着功率增加,提取率升高,在同一时间时200和250 W的提取率差异较小,100和150 W的差异较小。(5)采用响应面试验设计优化MAE和UAE提取工艺,结果MAE的最佳工艺为50%乙醇为溶剂,溶剂量42 m L/g,微波功率400 W,温度70℃,提取时间1.5 min;UAE优化的条件为乙醇浓度51%,超声波功率200 W,溶剂量32 mL/g,温度30℃,提取时间37 min。该研究系统的阐明了MAE和UAE提取过程中不同结构的多种化学成分的溶出过程及影响因素,为进一步研究MAE和UAE提取机制提供了重要的实践参考和理论探索。2.为了确定合理的采收期,便于开展资源评价,对连翘叶和果多成分代谢进行了系统研究:(1)总体看,叶和果中各成分代谢变化趋势相似,除yzga外,各成分在长短花柱叶和果中的含量均随时间延长呈下降趋势。各成分在5-7月份时变化较为明显,zga、yzga、ld、lqg和szcg在长短花柱植株间均表现出一定差异,但泰安和莱芜两地的结果并不一致,说明长短花柱间的这些差异可能是由环境引起。(2)连翘叶和果实中次生代谢产物多在8-9月份趋于稳定,有利于药物资源评价时叶和果采收期的确定,减少样品间的差异;同时也表明作为药材,9月份采集时叶和果质量稳定性更好。该研究阐明了连翘长短花柱多成分的代谢变化、差异和变化趋势,对于进一步研究连翘的次生代谢产物变化机制及采收期的确定具有重要的理论意义和指导作用。3.采用hplc法测定了不同来源连翘花中绿原酸(lys)、芦丁(ld)、连翘酯苷a(zga)、松脂醇β-d-葡萄糖苷(szcg)、连翘苷(lqg)、松脂酚(szf)和连翘脂素(lqzs)七种主要成分的含量。结果表明花中ld和szcg的含量都较高,其次是zga和szf。ld,szcg和zga在野生与栽培的长短花柱植株间存在显著差异。对于短花柱植株,野生连翘中ld和zga的含量显著高于栽培连翘。对于szcg,栽培型长花柱连翘中的含量显著高于野生的短花柱植株中的含量。由于不同来源花中成分的巨大差异,作为药物资源需进行分类研究。结合q型聚类分析和花的化学成分谱,将连翘花药物资源分为五种化学类型,分别为富含芦丁型、富含松脂醇葡萄糖苷型、富含连翘酯苷a型、低活性成分型和多木脂素型。4.采用hplc法测得连翘叶中ld、zga、szcg、lqg、szf、lqzs、yzga的含量。(1)ld和yzga在长花柱植株的栽培型与野生型间未见显著差异,但短花柱植株的栽培型与野生型间却具有显著差异(p<0.05)。而zga、szcg和lqzs在长花柱植株的栽培与野生种间表现出显著差异(p<0.05)。但对于同是野生或同是栽培的长短花柱植株间未见成分含量的差异。说明长短花柱植株叶中成分代谢对环境的响应有一定的差异。对于长花柱植株,野生品种中主要有效成分含量更高。(2)ld、zga和lqzs的含量在山东泰山、徂徕山、莲花山、鲁山野生连翘中存在显著差异(p<0.05),莲花山和徂徕山的样品中ld和zga的含量显著高于泰山和鲁山的;而鲁山的样品中lqzs的含量显著高于其他地区。(3)由于不同来源叶中成分的巨大差异,作为药物资源需进行分类研究。根据q型聚类结果,结合连翘叶的化学成分谱,将连翘叶药物资源分为五种化学类型,分别为富含连翘脂素型、富含连翘酯苷a型、高活性成分型、低活性成分型和一般型。5.采用HPLC法测得连翘果实中LD、ZGA、SZCG、LQG、SZF、LQZS以及YZGA的含量。(1)LD、LQG在野生与栽培以及长短花柱植株间未见显著差异。对于长花柱植株,YZGA和SZCG在野生与栽培间具有显著差异(p<0.05)。ZGA正好相反,野生短花柱植株中ZGA含量显著高于栽培短花柱植株(p<0.05)。采收时加以区分有利于提高药材的质量均一性。(2)LD、YZGA、LQG、ZGA在山东不同地区连翘间均存在显著差异(p<0.05)。徂徕山和莲花山的果实中各成分的含量均高,泰山样品中LQG含量最低。和山西太行山连翘相比,太行山连翘的一个显著特点是SZCG的含量显著低于山东各产区,而LQG的含量却最高。(3)不同产地连翘果实中主要成分存在巨大差异,作为药物资源需进行分类研究。根据Q型聚类结果,结合连翘果实的化学成分谱,将连翘果实分为三种化学类型,分别为高活性成分型、中等活性成分含量型和低活性成分含量型,这些分类为连翘药材分级奠定了基础。以上基于化学成分,以药用价值为核心对连翘花、叶、果进行的化学分类为连翘新药物资源的开发和合理应用奠定了重要基础,在药物应用中可以根据临床和生产需要选择连翘不同的部位和不同的化学类型。6.根据连翘叶和果形态性状和多种化学成分,开展山东连翘的种质资源分类评价。(1)根据叶和果的化学成分进行化学分类研究,将山东连翘资源分为六种化学类型。结果表明山东连翘种质资源呈现明显的化学多样性,具有明显的地域性,也存在一些特殊种质。主成分分析和R型聚类结果表明,果中ZGA、SZF、LQG、SZF,叶中ZGA、LD、LQG、SZF、LQZS 9个指标对连翘种质资源化学分类具有重要意义。(2)通过对连翘叶和果的形态性状的调查分析,可以将连翘分为不同的形态类型。叶和果形态性状的聚类分析表明,山东连翘种质资源在外观形态上在不同地域和同一居群内都呈现一定的多样性。(3)对形态性状和成分含量的相关性分析表明叶长、叶宽、叶长宽比、果宽、果长宽比、果尖长、果实表面星点与叶和果中多种化学成分的含量具有一定的相关性。因此从叶和果的外观形态上能够对叶和果的内在质量进行一定的判断。(4)连翘花粉粒形状主要有三种:近橄榄球形、近腰鼓形以及近球形。赤道面观近椭圆形或近菱形,极面观多近圆形,三条萌发沟延伸达两极,表面网状纹饰。短花柱植株花粉的极轴和赤道轴长显著高于长花柱植株(p<0.001)。