前言胰岛素是一种多生理功能蛋白质激素,在体内物质代谢中发挥极其重要的作用。胰岛素发挥生理作用的过程,大致有以下几步:(1)胰岛素与靶细胞上的胰岛素受体特异性结合;(2)胰岛素与其受体结合后发生一系列生化反应,使其生物信号得以转导和放大;(3)产生一系列生物效应。实际上胰岛素作用的发挥是生物信号发出、转导和实现的过程。在上述过程中、任何一个或数个环节的异常均可使胰岛素作用异常,胰岛素抵抗亦然。引起胰岛素抵抗的原因很多,大致有:(1)靶细胞内在缺陷;(2)影响靶细胞功能的继发性原因;(3)代谢因素;(4)胰岛素受体及受体后缺陷。丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白激酶B(PKB/Akt)在控制细胞存活、葡萄糖代谢(糖原合成、糖酵解、葡萄糖摄取)及蛋白质合成等重要细胞功能中起关键作用。PKB介导的信号转导系统参与胰岛素介导的葡萄糖转运调节,而且细胞内的胰岛素抵抗机制包含PKB激活作用受损。Akt作为胰岛素受体和PI-3K和下游分子对胰岛素代谢、信号转导和葡萄糖转运起重要作用。Akt酶在胰岛素激活下的活性下降是导致GLUT4易位、葡萄糖转运损害从而产生胰岛素抵抗的一个重要的原因,但Akt激活作用受损与胰岛素抵抗是否有直接关系还存在争议。PKB的靶蛋白即PKB的直接底物有:磷酸果糖激酶2,与糖酵解的调控有关,糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3,GSK3),受PKB磷酸化后GSK3活性降低,在使糖原合成酶因磷酸化减少而活性增加,从而导致糖原合成增加。此外,GSK3与mRNA转录起动的活化也有关。研究发现2型糖尿病病人的GSK-3活性是非糖尿病者(包括肥胖非2型糖尿病者)的两倍。由于高血糖、高胰岛素血症可引起GSK-3升高,后者通过促使IRS-1丝氨酸磷酸化而抑制骨骼肌组织的胰岛素信号转导,导致进一步的葡萄糖利用障碍,最终发生2型糖尿病。PKB的另一靶标是核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,P70S6K),P70S6K是促进蛋白质合成的蛋白激酶,但目前不能肯定P70S6K是否直接受PKB磷酸化。目前对PKB的研究较多,但对其下游信号GSK、P70S6K的研究较少,尤其是比较由高脂、高糖引起的胰岛素抵抗是否有一致的信号传导,目前尚未见报道。本研究拟采用高胰岛素-正血糖钳夹技术、组织病理学、免疫印记技术、放射免疫技术、RT-PCR等不同的检测方法对胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织进行上述指标的检测,进一步探讨胰岛素抵抗发生的分子生物学机制。实验材料与方法一、实验动物实验动物:Wistar雄性大鼠40只(中国医科大学实验动物中心提供),4周龄,随机分为4组饲养,每组10只。即:普通饲料组、高糖饲料组、高脂饲料组、高糖高脂组。各组饮食喂养大鼠8周后,处死大鼠,采血,留取肝脏、骨骼肌、脂肪组织,速冻后,—70℃冰箱保存。二、主要实验方法(一)胰岛素抵抗的评估:以高胰岛素—正血糖钳夹实验,评估大鼠是否产生胰岛素抵抗并对抵抗程度进行评估(二)血清TC、TG、HDL—C、LDL—C的测定:应用美国Abbortt Arrosset全自动生化分析仪。(三)血清hsCRP、FFA、INS测定:应用酶联免疫吸附法。(四)大鼠组织AKT的表达:应用免疫组化方法。(五)大鼠组织PI3K、GLUT4的表达:应用原位杂交方法。(六)大鼠组织IRS-1、GSK3、P70S6K的表达:应用免疫印记方法。(七)大鼠组织GSK3、P70S6K的表达:应用RT-PCR方法。结果(一)各组大鼠体重变化及附睾脂肪垫重量:体重增加最多的是G组,依次为Z组,T组,C组体重增加最少,附睾脂肪垫最重为G组,依次为Z组,T组,C组,附睾脂肪垫重量T组大于C组,但无统计学差异(P=0.02),其它各组之间均有统计学意义。(二)血清胰岛素检测:G组与Z组的血清胰岛素的水平明显高于C组和T组(P＜0.01),而C与T组之间、G与Z组之间无统计学差异,P分别为0.421和0.594:各组之间血糖水平无明显差异;GIR的结果:G组与Z组的GIR的水平明显低于C组和T组(P＜0.01,而C与T组之间无统计学差异,P=0.194)。(三)血清血脂系列检测:主要检测的指标是甘油三酯(Trig)、总胆固醇(Chol-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)。1、G与Z组的血清Trig的含量明显高于C组(P＜0.01),G组明显高于其它三组,Z组高于T组,T组高于C组,但两组之间无统计学差异(P＞0.05);Z组高于C组,两组之间统计学差异明显(P＜0.01)。2、G与Z组的血清Chol的含量明显高于C组(P＜0.01),G组明显高于其它三组,Z组高于T组,T组高于C组,但两组之间无统计学差异(P＞0.05):Z组高于C组,两组之间统计学差异明显(P＜0.01)3、G与Z组的血清LDL-C含量均明显高于C与T组(P＜0.05),G与Z组之间无显著性差异;C与T组之间无统计学差异(P＞0.05)。(3)G与Z组的血清HDL-C含量低于C与T组(P＜0.05),G与Z组之间,C与T组之间无统计学差异(P＞0.05)。4、HDL-C血清含量均明显高于C与T组(P＜0.05),G与Z组之间无显著性差异;C与T组之间无统计学差异(P＞0.05)。(3)G与Z组的血清HDL-C含量低于C与T组(P＜0.05),G与Z组之间,C与T组之间无统计学差异(P＞0.05)。(四)血清游离脂肪酸(FFA)、非特异性炎症指标——超敏C反应蛋白检测:1、G与Z组的血清FFA含量高于C与T组(P＜0.05),G与Z组之间,C与T组之间无统计学差异(P＞0.05)。2、G与Z组的血清hs-CRP含量高于C与T组(P＜0.05),G与Z组之间,C与T组之间无统计学差异(P＞0.05)。(五)FFA与体重、附睾脂肪垫重量、hsCRP呈明显的正相关,与GIR呈明显的负相关。GIR与体重、附睾脂肪重量、hsCRP呈明显的负相关。(六)IRS—1、PI3K、P70S6K在胰岛素抵抗大鼠肝脏、肌肉、脂肪中的表达IRS—1、PI3K在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显低于正常大鼠,P70S6K在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显高于正常大鼠。(七)AKT、GLUT4、GSK-3在胰岛素抵抗大鼠肝脏、肌肉、脂肪中的表达AKT、GLUT4在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显低于正常大鼠,GSK在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达明显高于正常大鼠。结论(一)高糖高脂饮食、高脂饮食饲养8周可成功的诱导Wistar大鼠产生胰岛素抵抗,单纯高糖饮食未出现胰岛素抵抗。(二)胰岛素抵抗大鼠的体重、FINS、FFA、TC、TG、附睾脂肪垫重量、hSCRP均显著高于非胰岛素抵抗大鼠。(三)胰岛素抵抗的形成与高水平的游离脂肪酸有关;与炎症反应有关。(四)IRS-1、PKB、GLUT4、PI3K在胰岛素抵抗大鼠的肝脏、肌肉、脂肪中的表达减少或消失,并且减少的程度与IR程度有关。(五)GSK-3、P70S6K在胰岛素抵抗大肝脏、肌肉、脂肪中的表达增加,与FFA正相关,与GIR呈负相关。