研究背景及目的Duchenne型肌营养不良症(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)是一种X连锁隐性遗传性致死性疾病,以进行性四肢近端骨骼肌萎缩无力、小腿腓肠肌假性肥大为特征,是最常见的神经肌肉疾病,发病率为1/3500男婴。定位于X染色体短臂(Xp21.1—21.3)上的抗肌萎缩蛋白(Dystrophin, Dys)基因(即DMD基因)突变是本病致病的根本原因,其编码427KD的细胞骨架蛋白即抗肌萎缩蛋白(dystrophin)。抗肌萎缩蛋白可维系和保持肌纤维膜的稳定,可防止肌肉收缩时的各种机械因素的损伤。DMD基因发生的无义突变、移码突变等导致患者肌肉中抗肌萎缩蛋白完全缺乏或者产生截短的无功能的蛋白,导致肌纤维逐渐变性、坏死等DMD具有诊断意义的特征性病理表现。DMD患儿虽然在新生儿期就出现肌纤维坏死及血清CK升高,但早期肌肉无力的症状常未引起重视,直到2～3岁左右才被发现。确诊指标包括DNA遗传学分析和(或)抗肌萎缩蛋白检测。3～5岁左右患者出现典型的鸭步步态,起立及上楼梯困难。随后出现腓肠肌假性肥大、四肢近端肌肉无力,Gowers征阳性。疾病进展导致的脊柱前凸使患者生活依赖轮椅。进行性的肌肉衰退导致患者在9～13岁丧失行走能力,且呼吸肌、心肌逐渐累及。20岁左右因呼吸肌、心肌萎缩、无力,呼吸和(或)循环衰竭而死亡。尽管明确DMD疾病基因及病理基础已有20余年,但尚无有效阻止病情不可逆性恶化和治愈的方法。药物治疗、成肌细胞移植治疗(Myoblast Transplantation Therapy,MTT)效果欠佳,基因治疗和iPS细胞(induced pluripotent stem cells)治疗存在导致细胞突变、原癌基因激活的风险。DMD不仅使得患者幼小心灵遭受疾病折磨,更给家庭和社会造成巨大的经济和身心负担。干细胞的横向分化理论为造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)治疗DMD提供了理论基础。1999年Gussoni等证实了骨髓造血干细胞、全骨髓细胞均具有向肌细胞转化的潜能,2000年,中山大学附属第一医院神经科DMD研究课题组观察到经骨髓干细胞移植治疗的mdx鼠运动功能及生命期限明显优于对照组,肌肉活检证实抗肌萎缩蛋白表达。2002年Gussoni等报道1例1岁时由于严重的X连锁联合免疫缺陷而接受骨髓移植并在12岁时被确诊为DMD的患者,该患者DMD恶性进程明显得到遏制,肌肉活检发现了有供者来源的肌肉细胞,证实外源性人类造血干细胞具有向骨骼肌细胞分化发育的能力。众多动物试验及临床个案的成功为异基因造血干细胞移植(Allo-HSCT)治疗DMD提供了有力的证据,为DMD治疗带来了新的希望。HLA单倍体相合造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation, haplo-HSCT)解决了异基因供者来源问题。但与HLA全相合相比,HLA单倍体相合造血干细胞移植存在植入失败率高、造血重建慢、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)反应重、免疫重建迟、致死性感染发生率高、移植相关死亡率高等风险。近年来,随着造血干细胞移植相关技术的不断发展和成熟,HLA单倍体相合的造血干细胞移植发展迅速,已成功跨越HLA限制,使单倍体相合干细胞移植成为治疗的可选择方案之一。本课题在伦理委员会的批准下,开展了HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗DMD的临床初步研究。方法1.研究对象的选择本课题以基因和蛋白诊断明确的DMD患者为主要研究对象,选取标准包括：4岁<年龄<16岁,肝肾功能正常(排除因DMD引起的肝酶升高及肌酐异常),左室射血分数(Left Ventricular Ejection Fractions, LVEF)值>40%,患者及其家属自愿申请参加此临床研究,了解治疗风险,签署知情同意书,并且获得珠江医院伦理委员会批准。DMD患者的健康直系亲属作为供者选择人群,采用直接核苷酸序列分析(Sequenceing-based typing,SBT)进行HLA配型的检测,选择与患者至少5/10相合的亲属作为供者。2.移植方案患者移植前进行自体造血干细胞动员、分离、冻存备用,保证患者安全。4例患者均选用清髓性的FBCA预处理方案：氟达拉滨Flu30mg/m2/d×5d (-9,-8,-7,-6,-5d)：白舒非BU0.8mg/kg/q6h/d×4d (-8,-7,-6,-5d);环磷酰胺CY60mg/kg/dx2d (-3,-2d);兔抗人胸腺细胞球蛋白ATG2.5mg/kg/dx5d (-5,-4,-3,-2,-1d)。供者经G-CSF动员后分离采集外周血/骨髓干细胞,分离结束30min内输注给患者。应用环孢素A (CsA,3mg/kg/d)+短疗程甲氨蝶呤(MTX,+1d15mg/m2,+3、+6、+11d分别10mg/m2)的方案预防GVHD的发生。应用前列腺素E1、肝素钠预防肝静脉阻塞病的发生,应用美司钠解救、水化、利尿、碱化等预防出血性膀胱炎(hemorrhagic cystitis, HC)的发生,患者术前应用更昔洛韦清空病毒及抗感染药物的预防性、及时应用预防重症感染的发生。移植+1d起使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、重组人血小板生成素(TPO)等刺进造血功能恢复,促进造血重建。3.术后造血及植入情况的监测术后检测血常规明确患者造血重建情况。供受者性别不同者应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)的方法检测X、Y染色体探针信号明确嵌合比例。供受者性别相同者应用定期用短串重复序列聚合酶链反应(polymerase chain reaction with short tandem repeat,STR-PCR)技术检测患者外周血的短片段核苷酸重复序列,明确植入状态。4.术后原发病的监测术后每周检测患者血清CK等肌酶的变化,择期对患者外周血进行DMD相关基因的检测,明确基因纠正情况。随访观察评估患者肢体运动功能和检查肌力、反射的变化。结果1.4例患者纳入本研究4例男性患者符合纳入标准,入组本研究。中位年龄9岁(6～16岁),以下称病例1、病例2、病例3、病例4。4例患者DMD基因检测结果分别为Exon51缺失、c.2804-1G>T突变、Exon2-44缺失、E6c.436C>T突变。4例DMD患者与供者HLA配型均为单倍体相合,相合位点依次为5/10(母亲)、7/10(父亲)、6/10(母亲)、5/10(母亲),其中病例3供受者血型不合(供者A型,受者O型)。2.移植干细胞数4例患者接受供者外周血及骨髓单个核细胞(mononuclear cell, MNC)的中位细胞数为8.19×108/kg。其中病例1输注2次供者外周血干细胞、1次骨髓干细胞,3次共接受MNC为6.68×108/kg。病例2接受外周血及骨髓干细胞各1次,MNC总数为10.6×108/kg。病例3和病例4只接受1次外周血干细胞,MNC分别为9.7×108/kg、5.56×108/kg,病例4接受的CD34+细胞数为2.45×106/kg。3.造血重建及植入情况4例患者移植后造血均成功重建。中性粒细胞>0.5×109/L的中位时间为+11d(+10d～+13d)。脱离输注,血小板维持在>20×109/L的中位时间为+10.5d(+10d～+13d)。血红蛋白>90g/L的中位时间为+12.5d(+12～+28d)。4例患者多次检测结果均显示完全独立植入。病例1移植+14d应用STR-PCR检测示供者独立植入,+83d、+343d、+507d应用FISH法检测结果均提示完全嵌合。病例2在+13d STR-PCR检测提示供者独立植入。病例3在+15d FISH检测提示完全嵌合。病例4移植+15d、+87d FISH检测均提示完全嵌合。病例3供受者血型不合(患者为A型,供者为O型),在移植后+90天左右,患者血型转变为O型。病例1术前合并G6PD酶缺乏症,术后经检测G6PD酶缺乏已被纠正。4.移植相关并发症的发生情况4例患者造血重建后均出现了Ⅰ度aGVHD,发生aGVHD的中位时间为+23d(+15d～-+33d)。2例患者出现了Ⅰ度cGVHD,发生的中位时间为10.5d(+108～+113d)。给与糖皮质激素、CD25单抗、间充质干细胞输注等处理后得到有效控制。目前4例患者分别随访至+654d、+338d、+325d、+275d,均无GVHD症状。4例患者中病例1和病例4分别于+30d、+27d出现了出血性膀胱炎,4例患者中有3例患者发生口腔黏膜炎(oral mucositis,OM),出现OM的中位时间为+4d(-11～+17d)。只有病例4,于+194d出现并发带状疱疹。4例患者均出现不同程度的感染,其中3例为肺部感染,1例表现为肠道感染,只有1例患者在+5d时出现CMV感染。经对症抗感染治疗后,感染均得到有效控制,未出现重症感染相关并发症。5.术后原发病变化情况本研究中4例患者移植后外周血血清肌酶较移植前有所下降,外周血检测基因缺陷被纠正。4例患者在移植后+50d内肌力较移植前稍有下降,+150d左右开始患者运动功能均有不同程度改善,双侧腓肠肌较前变软,并随着时间增加,肌力渐恢复至移植前水平。病例1随访至术后21月,患者肌力较前改善,表现为上肢持物力量的增加及行走时间的延长。其他3例患者术后随访至+338d、+325d、+236d,患者肌力稳定至术前水平,没有像其自然病程一样进行性恶化。结论1.HLA单倍体相合的造血干细胞移植虽然存在高风险,但仍可用于治疗Duchenne型肌营养不良症。2.应用FBCA的预处理方案可保证DMD患者异基因造血干细胞成功植入,环孢素A+甲氨蝶呤的方案可有效预防DMD患者在HLA单倍体相合造血干细胞移植术后严重GVHD的发生。3.DMD患者在HLA单倍体相合造血干细胞移植术后,外周血血清肌酶下降,缺陷基因被纠正,近期随访观察到患者运动功能不同程度改善。但其远期疗效仍需进一步随访、评估。