论文部分内容阅读
目的通过观察不同浓度碘对体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞的增殖或凋亡作用,探讨高碘对动脉血管的损伤作用及其机制。方法大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)置于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养。细胞处于对数生长期时进行实验。实验分为对照组和加碘组：加碘组根据碘浓度范围(0.075-7500mg/L)分为22组,以空白作为对照组。连续培养12h、24h和48h后分别收集细胞待用。采用细胞计数法检测细胞数量；四唑盐(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法测定细胞活性；瑞氏-吉姆萨染色(Wrigh-Giema staining)观测细胞形态；吖啶橙荧光染色(Acridine orang staining)观测细胞凋亡形态；Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡率；采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymersade chain reaction,RT-PCR)检测培养细胞中凋亡相关基因片段baxmRNA, bcl-2mRNA的表达水平；采用蛋白质免疫印迹技术(Western Bloting)测定ASK-1和TRX-1蛋白的表达水平。统计方法：多组间比较采用方差分析,两两比较采用Dunnett t检验。结果1细胞计数加含不同浓度的碘培养液分别培养12、24、48小时。细胞培养12小时后,加碘组与对照组相比,碘浓度范围为O.075-3750mg/L时,细胞生长正常(P>0.05),碘浓度为5250mg/L时可以明显抑制细胞的生长(P<O.01),抑制作用与碘浓度呈正相关关系；细胞培养24小时后,加碘组与对照组相比,碘浓度范围为0.075-1500mg/L时,细胞生长正常(P>0.05),碘浓度为3000mg/L时可以明显抑制细胞的生长(P<0.01),抑制作用与碘浓度呈正相关关系；细胞培养48小时后,加碘组与对照组相比,碘浓度为0.075-1120mg/L时,细胞生长正常(P>0.∞),碘浓度为2250mg/L时可以明显抑制细胞的生长(P<O.01),抑制作用与碘浓度呈正相关。随着碘浓度的升高,碘对细胞生长的抑制作用与碘浓度呈正相关。2MTT测定细胞活性将细胞置于不同浓度碘培养液中分别培养12、24、48小时。细胞培养12h后,加碘组与对照组相比,碘浓度为2250mg/L时,细胞生长正常(P>0.05),当碘的浓度在3750mg/L以上时,碘浓度为时可以明显抑制细胞生长(P<O.01),抑制作用与碘浓度呈正相关关系；细胞培养24小时后,加碘组与对照组相比,碘浓度为1500mg/L时,细胞生长正常(P>0.05)。碘浓度为3000mg/L时可以明显抑制细胞的生长(P<0.01),抑制作用与碘浓度呈正相关关系；细胞培养48小时后,加碘组与对照组相比,碘浓度为600mg/L时,细胞的生长正常(P>0.05)。碘浓度为1500mg/L时可以明显抑制细胞活性(P<0.01),且抑制作用与碘浓度呈正相关关系。3细胞形态学观察3.1瑞士-吉姆萨染色观察细胞形态与对照组比较,碘浓度为1500mg/L及以下时,细胞形态正常,无明显变化,从3750mg/L开始加碘组的细胞数量随浓度增大而减少,平滑肌细胞收缩变形,细胞间隙增大。随着浓度的升高,细胞膜损伤,细胞核固缩,细胞呈星形及多边型,出现“裸核”,甚至可见网状的染色质结构。3.2吖啶橙细胞染色观察细胞形态与对照组比较,碘浓度为1500mg/L及以下时,细胞没有明显变化,细胞结构完整。但是当碘浓度增大到3750mg/L以上时,细胞形态逐渐1i规则,细胞膜损伤,细胞质减少；细胞质致密化,与周围细胞联系中断；细胞核变形明显,聚集在细胞边缘。随着碘浓度的升高,荧光碎片逐渐增多,在高浓度时可见凋亡小体。4流式细胞术检测细胞凋亡率细胞培养液中加入不同浓度碘培养细胞48h后,与对照组相比,碘浓度为750mg/L时,细胞生存率明显降低(P<0.01)；随着碘浓度的升高,细胞生存率逐渐降低；碘浓度为750mg/L时,细胞凋亡率明显升高(P<0.01),随着碘浓度的升高,细胞凋亡率逐渐升高。5碘对A7r5细胞中bax mRNA和bcl-2mRNA的表达的影响细胞培养液中加入不同浓度碘培养细胞48h后,碘浓度为750mg/L时,与对照组相比,bax mRNA和bcl-2mRNA表达变化,差异有统计学意义(P<0.05)；碘浓度为1500mg/L开始,bcl-2mRNA表达逐渐减弱,差异有统计学意义(P<0.01);bax mRNA表达逐渐增强,差异有统计学意义(P<0.01)6碘对A7r5细胞内ASK-l和TRX-1蛋白的表达的影响细胞培养液中加入不同浓度碘培养细胞48h后,碘浓度为750mg/L时,与对照组相比,细胞的ASK-1和TRX-1蛋白表达水平均有显著变化(P<0.01)。随着碘浓度的升高,ASK-1蛋白表达逐渐减弱,差异有统计学意义(P<0.01)TRX-1蛋白表达逐渐增强,差异有统计学意义(P<0.01)结论1、一定浓度的碘对大鼠胸主动脉平滑肌细胞的生长具有一定的抑制作用,细胞活性降低,且呈时间-剂量关系；2、高浓度的碘可以使大鼠胸主动脉平滑肌细胞的形态发生改变,并且可以导致细胞凋亡；3、高浓度的碘可以导致大鼠胸主动脉平滑肌细胞凋亡率升高,促进细胞凋亡；4、高浓度的碘不仅能够增强促凋亡mRNA bax和促凋亡蛋白TRX-1的表达,而且能够抑制抑凋亡mRNA bcl-2和抑凋亡蛋白ASK-1的表达,从而促进细胞凋亡以上结果提示高浓度碘对大鼠胸主动脉平滑肌细胞产生一定损伤作用,可能是导致动脉血管硬化的机制之