全身麻醉应用于临床已有160多年的历史,但全麻药的作用机理迄今还不完全清楚。全麻药物是如何引起机体意识丧失、遗忘、制动等全麻效应的?全麻药物作用的中枢靶点是什么?仍是未解之谜。多年来,科学界从整体、细胞和分子等不同水平对此进行了不懈的探索。虽然这些研究还远未阐明问题的实质,但已肯定的是:全麻药物是通过作用于中枢神经系统而产生意识丧失、遗忘和制动等麻醉效应的。细胞内信号转导分子分布广泛,反应迅速,调控着细胞的各项生理功能。细胞外信号调节激酶(ERK1/2)是一种重要的细胞内信号调节分子,在神经系统中表达广泛,当细胞受到外界刺激时其磷酸化(pERK1/2)水平会发生快速变化。本实验室既往的研究发现,吸入全麻药异氟醚和七氟醚可以引起小鼠脑内一些部位和核团的pERK1/2明显增强或减弱,并且这种改变与动物的麻醉-清醒过程之间存在着高度的一致性,提示这些脑区内ERK1/2磷酸化与全麻的产生或效应之间可能有密切的关系。本研究的第一部分在前期观察了吸入麻醉诱发脑内pERK1/2变化的工作基础上,进一步观察了异丙酚、氯胺酮静脉麻醉对脑内pERK1/2的影响,以图发现与吸入和静脉麻醉相关的脑内核团的共性和区别,籍以为筛查与全麻效应相关的脑内核团提供线索。在此基础上,本研究的第二部分,我们选择在三种药物全麻时pERK1/2水平都明显变化的核团——EW核和杏仁中央核,用免疫荧光双标和脑内核团毁损方法,探讨了这些核团在全身麻醉的产生和/或效应中有无作用,为寻找全麻药中枢作用的可能靶位积累资料。蛋白激酶C(PKC)是另一种重要的细胞内信号转导分子,调节细胞内许多重要的生理功能。既往许多离体研究发现,PKC可能是全麻药中枢作用的一种潜在靶分子,因而在本研究的第三部分,我们通过观察PKC抑制剂白屈菜红碱对小鼠七氟醚麻醉效应的影响,了解PKC在全身麻醉中的具体作用。SynapsinⅠ(突触蛋白Ⅰ)是一种突触囊泡相关蛋白,其多个位点受蛋白激酶磷酸化,通过磷酸化和去磷酸化调节神经递质的释放。那么,全麻药是否通过调节synapsinⅠ的磷酸化从而调节神经递质的释放呢?在本研究的第四部分,我们初步观察了七氟醚麻醉对小鼠大脑感觉运动皮质区synapsinⅠ磷酸化的影响,以了解全麻药对突触传递的作用。第一部分静脉全麻药对小鼠脑内pERK1/2表达的影响1.异丙酚、氯胺酮及七氟醚麻醉小鼠脑内pERK1/2表达变化的比较60只成年雄性BALB/c小鼠,随机分为未麻醉对照组和异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉组。对照组吸入纯氧5 min后直接脱臼处死;异丙酚及氯胺酮麻醉组分别腹腔注射异丙酚或氯胺酮100mg/kg后纯氧吸入。七氟醚组以1MAC吸入30min后用高流量氧洗脱。分别于清醒状态和麻醉5min、麻醉后清醒5min及麻醉后清醒1h脱臼处死,灌注固定后取脑切片,免疫组织化学染色,观察并对比三种全麻药在麻醉的不同时间点脑内pERK1/2表达水平的变化。结果发现:三种全麻药麻醉-清醒过程中,小鼠脑内pERK1/2阳性细胞变化部位大致相似。麻醉时ERK1/2磷酸化发生抑制的部位主要为海马和广泛的皮质区域,对照组小鼠脑内一些pERK1/2阳性细胞分布较多的部位如感觉运动皮质、嗅周皮质、梨状皮质、扣带皮质等,阳性细胞数在异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5 min后均较对照组明显减少(P<0.05)。清醒5 min后,pERK1/2阳性细胞数均有所回升(与麻醉5 min组相比,P<0.05);清醒1h后恢复到对照组水平(与清醒对照组比P>0.05)。海马pERK1/2阳性细胞数在三种药物麻醉后均明显减少,七氟醚组清醒5min后即恢复正常,但异丙酚和氯胺酮组清醒1h仍未恢复。另一方面,ERK1/2磷酸化增强的主要是皮质下核团,对照组中一些pERK1/2无表达或低表达的皮质下核团如杏仁中央核、臂旁外侧核、延髓腹外侧网状核、视上核和EW核在三种药物麻醉5 min后pERK1/2阳性细胞数均较对照组明显升高(P<0.01),清醒5 min后明显回落,清醒1h已恢复至对照组水平(与对照组比P>0.05)。此外,三种全麻药物麻醉时脑内pERK1/2表达增强的皮质下核团不尽相同。异丙酚麻醉时缰外侧核(LHb)阳性细胞明显增多,清醒后恢复,而氯胺酮和七氟醚无此变化;氯胺酮麻醉时丘脑室旁核的pERK1/2阳性细胞激活较异丙酚和七氟醚麻醉时更为明显。另外更重要的是,两种静脉全麻药异丙酚和氯胺酮麻醉时下丘脑腹内侧核腹外侧部(VMHvl)阳性细胞激活增多,而吸入全麻药七氟醚麻醉时未见此种变化。2. pERK1/2与GABA能神经元的关系取对照组和异丙酚麻醉5min组小鼠全脑切片,每组三只小鼠,每只小鼠取一套脑片。作pERK1/2与GABA能神经元标志物GAD67的免疫荧光双标记。结果发现:对照组、异丙酚麻醉5min组皮质和海马有很少pERK1/2和GAD67双标阳性神经元,麻醉时皮质下pERK1/2阳性细胞数增多的各个脑区和核团未发现双标阳性细胞。第二部分EW及杏仁中央核在全麻效应中的可能作用1. pERK1/2与urocortin神经元的关系分别取异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min组小鼠中脑部位切片,每组三只小鼠,片厚40μm,作pERK1/2和urocortin免疫荧光双标记。结果发现:在异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉5min小鼠脑片上,中脑EW核内存在大量的pERK1/2和urocortin双标阳性神经元,提示urocortin神经元可能参与麻醉效应。2.毁损EW核或杏仁中央核对全麻效应的影响雄性SD大鼠,体重280-300g,在立体定位仪上行EW核和杏仁中央核直流电毁损。术后5天分别接受异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉,测量动物翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间。行为学测定结束后,动物灌注固定取脑,毁损部位切片HE染色。根据毁损情况分别进行EW和CeA核毁损成功和毁损失败统计。另取12只大鼠不毁损核团,仅给予麻醉,作为空白对照。结果发现:毁损杏仁中央核后,异丙酚和氯胺酮麻醉大鼠翻正反射的消失时间与毁损对照组相比无显著性差异(P>0.05);与毁损对照组相比,杏仁中央核毁损大鼠翻正反射的恢复时间在异丙酚麻醉组缩短(P<0.01),而氯胺酮组无统计学差异。毁损大鼠杏仁中央核对七氟醚麻醉大鼠的翻正反射消失时间和恢复时间均无明显影响。大鼠EW核毁损后异丙酚麻醉的翻正反射消失时间较毁损对照延长(P<0.01),而氯胺酮组无统计学差异;EW核毁损后大鼠翻正反射的恢复时间在氯胺酮麻醉组有所缩短(P<0.05),而异丙酚组无统计学差异。大鼠EW核毁损后七氟醚麻醉的翻正反射消失和恢复时间与毁损对照组相比均无统计学差异。第三部分蛋白激酶C在七氟醚麻醉效应中的可能作用75只雄性BALB/c小鼠,随机分为对照组和白屈菜红碱(CHE)2.5、5、10、20mg/kg组,每组15只。分别给予腹腔注射DMSO或CHE2.5～20mg/kg。腹腔注射后45min,每组取三只作皮层和海马pPKCγ的Western blotting检测,其余动物测定七氟醚麻醉的翻正反射消失时间(LORR)和夹尾反射恢复时间。结果:Western blotting分析表明应用白屈菜红碱后小鼠大脑感觉运动皮质区域pPKCγ较对照组表达降低(P<0.01)。与对照组比较,腹腔注射白屈菜红碱5mg/kg,10mg/kg和20mg/kg组七氟醚麻醉小鼠翻正反射消失时间(LORR)缩短(P<0.01),夹尾反射恢复时间延长(P<0.01)。第四部分七氟醚麻醉对小鼠脑内synapsinⅠ磷酸化的影响20只雄性BALB/c小鼠随机分为对照组和七氟醚麻醉30min组,每组10只。对照组直接脱臼处死。七氟醚麻醉组小鼠吸入1MAC七氟醚30min后脱臼处死。动物处死后每组取4只作皮质和海马磷酸化synapsinⅠ(pSYNⅠ)的western blotting分析,另6只灌注取脑,作大脑皮质部位pSYNⅠ的免疫组织化学分析。免疫组化结果显示:与对照组相比,七氟醚麻醉后小鼠大脑皮质区域pSYNⅠ阳性神经纤维表达量降低,具有显著性差异(P<0.01),Western blotting结果表明七氟醚麻醉小鼠感觉运动皮质pSYNⅠ/Actin的光密度比值与对照组相比也有下降的趋势,但无显著性差异(P>0.05)。结论1.异丙酚、氯胺酮与七氟醚麻醉下小鼠脑内pERK1/2阳性细胞变化部位大致相似。ERK磷酸化发生抑制的部位主要为海马和广泛的皮质区域包括感觉运动皮质、梨状皮质、扣带皮质和嗅周皮质等,可能与麻醉引起记忆与感觉认知缺失有关。而ERK磷酸化增强的主要是皮质下核团如杏仁中央核、下丘脑室旁核、视上核和EW核等。但不同全麻药引起皮质下pERK1/2增强的部位不尽相同,特别是下丘脑腹内侧核的腹外侧部只在异丙酚、氯胺酮静脉麻醉时被激活。这些核团在全身麻醉中具体起什么作用值得进一步研究。2.在对照和异丙酚麻醉的小鼠脑片上,极少发现pERK1/2和GAD67双重标记神经元。因此认为全麻下pERK1/2表达增强或者减弱的神经元并不是直接激活GABA能神经元。3.在异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉小鼠中脑EW核内存在大量的pERK1/2和urocortin双标阳性神经元。表明全麻时EW核pERK1/2表达增强与应激反应调节有关。4.毁损SD大鼠的杏仁中央核或EW核后,异丙酚、氯胺酮和七氟醚麻醉大鼠的翻正反射消失时间和翻正反射恢复时间并没有发生显著的改变,说明这两个部位在全麻意识消失的产生机制中不起关键作用。5.使用PKC抑制剂白屈菜红碱后,七氟醚麻醉小鼠翻正反射消失时间缩短,夹尾反射恢复时间延长,并且在一定范围内随剂量增大效应更加明显。提示在整体动物上抑制PKC活性可以增强全麻效应。6.七氟醚麻醉时小鼠大脑皮质区域pSYNⅠ阳性神经纤维表达量较对照组降低。提示全身麻醉时突触蛋白Ⅰ磷酸化降低,从而在突触前水平减少兴奋性神经递质的释放,可能是全麻药发挥作用的一个环节。