结核病（Tuberculosis, TB）是一种古老的且严重危害人类健康的疾病,也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）是引起结核病的病原体。由于耐多药菌株的出现和HIV（Human Immunodeficiency Virus）的协同作用,使得一度被控制的结核病的发病率在全球范围内显著回升,因此,寻找新一代抗结核药物己迫在眉睫。结核分枝杆菌细胞壁是细菌特有的、赖以生存的结构基础。其核心结构由最内层的肽聚糖（Peptidoglycan, PG）、中间层的聚阿拉伯糖半乳糖（Aribinangalactan, AG）以及最外层的分枝菌酸（Mycolic acid）所构成。聚阿拉伯糖半乳糖为连接肽聚糖和分枝菌酸、维持细胞壁结构完整性的重要组分,所以可作为研发新一代抗结核药物的理想靶标。而通过阐明现有药物的作用机制可以发现相关代谢中的关键蛋白并将其确定为潜在的药物靶点。抗结核的一线药物之一乙胺丁醇（Ethambutol,EMB）是抑菌剂,对细胞外繁殖期的结核分枝杆菌的生长有抑制作用,且不表现出明显的耐药性。美国科罗拉多州立大学微生物系Mike McNeil教授的一项实验结果显示,在结核分枝杆菌的培养基中加入乙胺丁醇后,细胞壁中的聚阿拉伯糖在短时间内大量流失,使得细菌表面的阿拉伯糖和半乳糖的含量比例发生明显改变,为了寻找EMB的作用机制以及与细胞壁表面多糖代谢变化的关系,前期本研究室的湛垚垚博士用双向电泳和质谱的方法找出了EMB作用于耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis, M.smegmatis） （因具有与M.tuberculosis相似的细胞壁结构且生长迅速,无病原性,而被用作M.tuberculosis的模式菌）前后的蛋白表达差异点。本论文的实验目的:根据本研究室湛垚垚博士的双向电泳和质谱结果,在NCBI基因数据库中寻找相关蛋白的基因序列,设计引物,采用RT-PCR（reverse transcriptase polymerase chain reaction,逆转录聚合酶链反应）的方法来检测EMB作用前后蛋白表达差异点所对应的基因的表达变化情况。如表达水平增高非常明显,则我们对相应基因在耻垢分枝杆菌中进行克隆表达,人为地提高相关基因的表达水平,最终用HPLC（high performance liquid chromatography,高效液相色谱）的方法检测细胞壁阿拉伯糖（Arabinose,Ara）和半乳糖（Galactose,Gal）的含量比例变化,如阿拉伯糖的比例降低,则说明所研究的基因与细胞壁多糖的代谢密切相关,为后续更深一步的探讨研究提供实验基础。本论文的实验内容及结果:1.筛选目的基因根据湛垚垚的质谱结果,对EMB作用前后表达变化差异性显著的蛋白在NCBI蛋白和基因数据库中寻其相对应的基因序列,设计引物,进行RT-PCR,最终选择了12个基因进行逆转录PCR实验,其中accA（MSMEG₀334,乙酰辅酶A羧化酶a亚基）、tpx（MSMEG₃479,巯基过氧化物酶）、tuf（MSMEG₁401,细菌翻译延长因子Tu）、bfr（MSMEG₃564,细菌铁蛋白）四种基因表达上调;groEL（MSMEG₀880,伴侣蛋白）、cys （ MSMEG₄190 ,肌醇单磷酸酶家族蛋白）、mtrA（MSMEG₁874,DNA结合反应调节蛋白）、hisA（MSMEG₃209,组氨酸合成异构酶）、fdxA （ MSMEG₁125 ,转录调节蛋白）、gpd（MSMEG₀777,依赖F420的六磷酸葡萄糖脱氢酶）、gk（MSMEG₆759,甘油激酶）、pst（MSMEG₅782,磷脂酸盐特异性转运系统蛋白）八种基因表达下调。根据Labworks凝胶成像分析系统分析的结果,我们选择表达上调最为显著的tuf基因作为目的基因进行克隆和表达。2.利用PCR方法扩增出正确的目的MSMEG₁401基因从NCBI基因数据库中获得mc2155菌株的MSMEG₁401基因核苷酸序列（1191bp）。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了NdeI和HindIII限制性内切酶位点。以便将MSMEG₁401基因连接到pVV2表达载体的NdeI和HindIII位点。用具高保真性的LA Taq DNA聚合酶,以mc2155菌株基因组DNA为模板成功扩增了MSMEG₁401基因。3.克隆MSMEG₁401基因及核苷酸序列测定将上述PCR产物连接到克隆载体pMD18-T的EcoRV位点,将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。经过蓝百斑筛选然后再用限制性内切酶酶切方法筛选出阳性重组质粒pMD18- MSMEG1401。对MSMEG₁401基因进行DNA序列测定,测序结果与耻垢分枝杆菌mc2155菌株基因组数据库中的MSMEG₁401基因序列完全一致,表明用PCR技术扩增的MSMEG₁401基因不存在任何碱基突变。4.表达载体pVV2-MSMEG1401的构建用NdeI和HindIII双酶切pMD18-MSMEG1401阳性重组质粒,回收与纯化MSMEG₁401基因后,将MSMEG₁401基因连接到表达载体pVV2的NdeI和HindIII位点,并用连接产物转化NovaBlue感受态细胞,用BamHI和KpnI双酶切方法鉴定重组表达载体pVV2-MSMEG1401。表达载体中的MSMEG₁401基因产物的N端与pVV2表达载体上的6个连续组氨酸标记形成融合蛋白,便于目的蛋白的检测。5. MSMEG₁401目的蛋白在耻垢分枝杆菌中的表达将表达质粒pVV2-MSMEG1401电转化到耻垢分枝杆菌mc2155菌株中,在37°C条件下表达目的蛋白。用SDS-PAGE电泳和Western blotting方法检测和鉴定目的蛋白的表达情况。6.用高效液相色谱法检测细胞壁阿拉伯糖和半乳糖的含量比例变化提取野生型和高表达MSMEG₁401蛋白的M.smegmatis mc2 155菌株的细胞壁多糖,制备阿拉伯糖和半乳糖的单糖,在一定色谱条件下,根据提取样品相应各组分的出峰面积大小来比较野生型和高表达MSMEG₁401蛋白的M.smegmatis mc2 155菌株的细胞壁阿拉伯糖和半乳糖的含量比例变化。结论:本课题利用分子克隆技术克隆了耻垢分枝杆菌的MSMEG₁401基因,并在耻垢分枝杆菌mc2155中高表达出MSMEG₁401目的蛋白。最终用HPLC的方法检验了MSMEG₁401蛋白是否与细胞壁多糖的代谢密切相关,为后期更进一步探讨该蛋白与聚阿拉伯糖的关系价值奠定了前提基础。