microRNA(miRNA)是一类由基因组特定基因转录、加工得到，长度约为18～25nt，能调节靶mRNA降解或阻遏其翻译的非编码小RNA。自1993年miRNA首次在线虫中被发现(1in-4)后，2002年，miRNA被证实也存在于植物中，随后植物中越来越多的miRNA相继被报道，其靶基因也有许多被预测。有关植物mRNA的特征、发生、作用机制和它的调控作用也日益引起人们的兴趣。 在miRNA成熟和行使功能的过程中需要两种蛋白的作用——Argonaute蛋白家族和Dicer核酸酶，在拟南芥中存在的Argonaute1(AGO1)蛋白和Dicer-like1(DCL1)蛋白就分别属于这两类家族。 AGO1基因(编码Argonaute1蛋白的基因)不仅参与RISC复合体的形成，是PTGS通路的重要基因，还参与siRNA和miRNA通路。有趣的是，AGO1本身是miR168的靶基因，因此miR168与AGO1之间存在着负反馈的调节关系。当miR168与靶mRNA序列即AGO1之间形成近乎完全的碱基配对时，可诱导AGO1的降解引起基因沉默。而在ago1突变体中分生组织的形成，细胞分裂，器官分化等过程会有不同程度异常。 Dicer核酸酶是一种双链RNA专一性内切酶，负责剪切miRNA前体形成成熟的miRNA。拟南芥dcl1突变体中，分生组织过量繁殖，决定花分生组织转化为不确定分生组织、花期延迟、miRNA及其靶基因表达水平均降低。由于DCL1基因(编码植物Dicer-like1核酸酶的基因)，参与miRNA成熟和行使功能，本身是miR162的靶序列。在miR162与DCL1之间也存在着负反馈调节机制，当miR162与靶mNA序列即DCL1之间形成近乎完全的碱基配对时，可诱导DCL1的降解引起基因沉默。 我们可以通过对AGO1，DCL1转录调控的研究来验证miRNA出现的时空性，从而发现miRNA的形成过程中的调控机制及miRNA对其它基因表达的调控。本文主要进行的是对AGO1、DCL1顺式作用因子的寻找。 1AGO1Cis-elements(顺式作用因子)的寻找 根据AGO1基因全长序列，分别设计一系列不同长度(5kb、4kb、2.3kb、1.2kb、750bp、500bp)的AGO1Promoter(启动子)，其后均接入Gus报告基因和nosterminator(终止子)，构建表达载体并转化拟南本芥；获得稳定转化子后，观察Gus表达，测定Gus活性，研究基因表达的时间和空间，寻找可能的调控区域。并据所得到的结果，做进一步的deletion，将调控区域更细定位。期望能对miR168出现的时空性，miRNA的形成过程中的调控机制及miRNA对其它基因表达的调控等方面的研究有推动作用。 目前已经得到的结果是：将AGO1的顺式作用因子定位在转录起始点处500bp至1.2kb片段内。要想将调控区域更细定位，得到更有利的结果，还需在这一区段内作更细的deletion，并测定Gus活性。 2DCL1Cis-elements(顺式作用因子)的寻找根据DCL1基因全长序列，分别设计一系列不同长度(5kb、4kb、2.3kb、1.2kb、750bp、500bp)的DCL1Promoter，其后均接入Gus报告基因和终止子，构建表达载体并转化拟南本芥；获得稳定转化子后，观察Gus表达，测定Gus活性，研究基因表达的时间和空间，寻找可能的调控区域。并据所得到的结果，做进一步的deletion，将调控区域更细定位。期望能对miR162出现的时空性，miRNA的形成过程中的调控机制及miRNA对其它基因表达的调控等方面的研究有推动作用。 DCL1顺式作用因子的定位还没有得到比较理想的结果。