骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是由机械性损伤和生物因素相互作用而导致的一系列病变。作为一种退行性关节紊乱性疾病,骨关节炎的主要特征表现为关节软骨被破坏、软骨下骨畸变、以及滑膜炎症等,严重影响着其患者的日常生活,在未来几年内骨关节疾病将会越发地引起人们的关注。有证据表明,在骨关节炎症处由于蛋白水解酶的过量表达而导致软骨的分解代谢能力增强,包括蛋白聚糖的损耗和II型胶原蛋白的降解。其中,木瓜类半胱氨酸蛋白酶家族的一员——组织蛋白酶K(Cathepsin K,Cat K)因可以在多个位点裂解胶原蛋白的三股螺旋结构,而成为治疗骨关节炎类疾病的药物靶标酶,在骨生物学研究中意义重大。基于腈类进攻基团的优势,本课题组多年来一直从事着此类组织蛋白酶抑制剂的设计、合成以及抑制机理的研究。经过进一步结构优化,本论文设计合成了一系列新型、且具有高选择性的肼腈类小分子抑制剂;在体外检测了它们对组织蛋白酶K的抑制效应和选择性;通过理论模拟研究了其构-效及抑制分子机理;最后检测了抑制剂的细胞毒性,并利用荧光和明胶酶谱法等在细胞水平上检测了组织蛋白酶K的活性。主要内容包括:一、在前期拟肽类抑制剂的研究基础之上,移除了P2-P3连接部位的酰胺键,得到了母体结构更加稳定的非肽类的新型抑制剂,并通过改变P3位的结构,优化其对Cat K的选择性。合成出的12种肼腈类抑制剂含对位和间位两种结构取向,并利用1H-NMR,13C-NMR,HPLC-MS等多种方法进行表征。之后利用荧光法检测抑制剂对组织蛋白酶的半数抑制浓度IC50,并计算出抑制常数Ki。结果显示,抑制剂对Cat K的抑制常数均在亚纳摩尔至纳摩尔级别,且对组织蛋白酶K和L,S,B的选择性有明显的提高,尤其是对高度同源的内肽酶Cat K和Cat L。与已发表过的Cat K的抑制剂相比较,13’更是兼顾了极佳的抑制效应(Ki=0.3n M)和选择性。二、利用理论模拟研究了抑制剂构-效关系及分子机理。以抑制剂6’和13’为例,共价对接结果显示:它们的P2、P3基团与组织蛋白酶K相对应的口袋有很舒适的匹配性,且与其中的氨基酸残基也有极佳的相互作用。相反地,它们与组织蛋白酶L的结合模式却大相径庭,P2、P3基团或伸向溶液中,或扭曲地据于口袋中,或相互作用力极弱。这些都很好地解释了抑制剂对组织蛋白酶K和L的高选择性。鉴于Gold软件在基于Glodscore Fitness分值预测抑制剂选择性方面所存在局限性,我们还对此做出了改进,使得理论模拟一定程度上更加合理。三、在细胞水平上研究抑制剂CKI-E(14’)和CKI-F(15’)的生物学性能。以刚出生5-6天的幼鼠(C57BL/6J Strain)为动物模型,获取原代软骨细胞,并利用不同方案培养、表达出大量的组织蛋白酶K。之后利用MTT比色法检测了抑制剂对三种不同细胞(MOVAS,MG-63和Primary chondrocytes)的存活率的影响,即细胞毒性测试;结果发现这两种小分子抑制剂对这三种细胞皆未产生任何毒性。为了表达更多的组织蛋白酶K,将软骨细胞传代或用抗坏血酸、β-甘油磷酸钠刺激,并通过明胶酶谱法和定量荧光法检测细胞内组织蛋白酶K的表达以及小分子抑制剂对组织蛋白酶K活性的抑制效应。结果表明:在经刺激或传代的软骨细胞中组织蛋白酶K的活性有大幅增加;且在传代的软骨细胞中,当加入抑制剂CKI-E,CKI-F之后,它们对组织蛋白酶K的活性也均有明显的抑制作用。在本论文中,我们结合了化学学科的有机合成、计算机学科的理论模拟、生物学科中的酶学和细胞学等多种技术和方法,对组织蛋白酶K的高选择性肼腈类小分子抑制剂在结构优化、有机合成、体外酶活检测、构-效关系及机理揭示、细胞毒性测试、以及细胞水平上对Cat K的活性调控等多方面做出系统研究,并得到了很好的结果。这为设计更高效、高选择性的Cat K抑制剂提供了理论基础,也为临床治疗骨关节炎提供了更多的理论依据。