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本论文包括三部分:(一)Alport综合征的分子遗传学研究;(二)SIOD的分子遗传学研究;(三)Alport综合征三家系的产前基因诊断。第一部分Alport综合征的分子遗传学研究研究背景:Alport综合征(Alportsyndrome,AS)是一种临床上以反复镜下或肉眼血尿,慢性肾功能不全为主的进行性遗传性肾炎,常伴有眼部病变和高频神经性耳聋。IV胶原α 3 (COL4A3)、α 4 (COL4A4)、α 5 (COL4A5)基因突变是导致Alport综合征病发的主要原因。本病的遗传方式主要分为常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和X-连锁显性遗传。其中由IV胶原α 5突变导致的X-连锁显性遗传是AS的主要遗传方式,约占AS的85%。由于AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5分别包含52、48和53个外显子,且基因变异横跨这三种胶原基因,故目前尚未发现存在突变热点。AS是一种具有临床异质性的基底膜肾病,临床诊断上有时易与薄基底膜肾病、局灶节段性肾小球硬化等肾脏疾病相混淆,造成误诊或漏诊。目前第二代高通量测序技术的发展为AS的基因诊断奠定了基础,使得快速高效的对AS致病基因的定位和突变类型的筛查成为可能。研究方法:本文收集了 6个疑似或确诊的AS的家系,利用全外显子组测序技术对AS的致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5进行突变筛查,通过PCR扩增和Sanger测序技术在家系中行突变位点的验证。对突变位点行序列同源性的比对,观察位点在进化上的保守性。同时采用生物信息学的方法对突变是否具有致病性进行分析。对于错义突变采用SIFT和Polyphen-2进行有害性分析,采用MaxEntScan观察剪切突变是否影响RNA的剪切。对200名正常对照行突变位点的测序,来排除突变位点为多态性位点的可能性。研究结果:通过全外显子组测序共检测出5个新的突变和2个已知的致病突变,其中包括 2 个新的 c.4348C>T (p.R1450X)、c. 352G>A(p.G118R) CO4A3突变,2个COL A 新的突变 c.3455-2A>G、c.3817G>A(p.G1273S)和 2 个已知的致病突变 c.796C>T (p.R266X)、c.2858G>T (p.G953V),1个COL4A4的新的突变c.1099G>A(p.G367S)。这些突变在AS家系中测序发现与疾病均呈共分离。同源性比对结果显示突变位点在进化上也是高度保守的。通过生物信息学对突变的致病性分析发现,无论是错义突变还是剪切突变对AS均是有害突变,一旦突变将影响基因的功能。结论:本研究共发现了 5个新的AS的致病基因进一步丰富了突变数据库,为疑似的AS从致病基因层面进行了确诊,避免了误诊或漏诊。进一步揭示了基因诊断对临床的具有重要意义,而致病基因的发现将为患者提供合理的预后治疗,并为家族成员的遗传咨询和产前诊断提供依据。第二部分SIOD的分子遗传学研究研究背景:Schimke 免疫骨发育不良(Schimke immunoosseous dysplasia,SIOD)是一种临床以脊柱骨骺发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia,SED),身材矮小,T细胞缺乏,进行性肾病综合征和特殊面容为主要特征的罕见的常染色体隐性遗传病。本病的发病率约为1:(100万～300万)。而SMARCAL1是目前SIOD唯一已知的致病基因,约有50%的患者无法检测到其致病突变。SIOD是一种具有临床异质性的累及多个系统的疾病,临床表现往往从轻度表型到严重表型不等。SMARCAL1基因突变中往往无义突变和错义突变居多,而错义突变易引起SIOD轻度的临床表型,而无义突变及与其他类型的组合突变都易造成严重的SIOD表型的出现。目前与国外研究相比,国内关于SIOD的研究还知之甚少。研究方法:本研究收集到一例临床表型疑似SIOD的患者,利用PCR扩增和Sanger测序技术对致病基因SMARCAL1基因行突变研究。然后对突变位点行序列同源性的比对,观察位点在进化上的保守性。同时采用生物信息学的方法对突变是否具有致病性进行分析。对于错义突变采用SIFT和Polyphen-2进行有害性分析,采用MaxEntScan观察剪切突变是否影响RNA的剪切。对200名正常对照行突变位点的测序,来排除突变位点为多态性位点的可能性。研究结果:通过直接测序发现了 2个SMARCAL1基因的突变c.1933C>T,(p. R645C)和c.2450G>A (p.R817H)。R645C突变来自临床表型正常的母亲,为已知的致病基因;而R817H为新的突变来源于临床表型正常的父亲。同源性比对结果显示这两个突变位点在进化上也是高度保守的。生物信息学对突变的致病性分析发现,R817H的错义突变SIFT软件的预测值为0和Polyphen-2软件预测值为1,此两个的值都说明突变对SMARCAL1基因功能的正常发挥是有害的。结论:本研究共发现了1个新的复合的SMARCAL1基因突变导致SIOD的发生,进一步丰富了SMARCAL 基因突变数据库,并对研究中的疑似SIOD患者从致病基因层面进行了确诊,避免了误诊或漏诊。进一步揭示了基因诊断对临床的具有重要意义,而致病基因的发现将为患者提供合理的预后治疗,并为家族成员的遗传咨询和产前诊断提供依据。第三部分Alport综合征三家系的产前基因诊断研究背景:Alport综合征临床表现最突出的是血尿,但是随着年龄的增长可出现少量蛋白尿甚至大量蛋白尿,并且最终逐渐进展为肾功能衰竭从而需要进行透析甚至肾脏的移植。然而目前Alport综合征尚无有效的根治办法且预后差,AS的产前诊断可以有效的避免患儿的再次出生以减轻家庭及国家的精神和经济压力。因此对于孕期的前期诊断尤其是产前基因诊断显得尤为重要。研究方法:收集AS三家系先证者及其父母的外周血,并分别采集先证者孕期为18周、20周和20周的母亲的羊水10ml。采用STR技术来排除母体细胞的污染,然后行PCR扩增,再进行DNA测序。研究结果:结果显示三家系的母体细胞均无污染,经过Sanger测序发现家系Ⅰ的先证者母亲羊水检测尚未发现胎儿携带同先证者相同的COL4A5基因c.1909C>T (p.637Q>X)的杂合无义突变,可以正常分娩;而家系Ⅱ的先证者母亲羊水检测显示胎儿携带有COL4A5基因c.1185-1186insC杂合插入移码,选择终止妊娠;家系Ⅲ的先证者母亲羊水检测显示胎儿并不携带COL4A3基因c.2810G>A和c.4793T>G的复合突变,可以正常分娩。结论:若已知AS家系中的致病突变,那么分子诊断可以为AS家系的早期和精准的产前诊断提供依据。