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第一部分小鼠睾丸热激前后测序的差异miRNA分析及验证【目的】对小鼠睾丸热激前后miRNA测序结果进行生物信息学分析及验证,以发现在睾丸热激致生精损伤的关键miRNA及重要途径。【方法】基于课题组之前测序结果,对得到的差异miRNAs(倍数≥2)进行生物信息学分析,包括用miRanda软件预测差异miRNAs靶基因,并对预测的靶基因进行GO富集和KEGG通路分析。然后43℃水浴小鼠睾丸,获取小鼠睾丸组织,分别提取热激前后小鼠的睾丸组织的RNA,然后用茎环引物RT-qPCR法验证miRNA测序结果。【结果】总共预测到差异miRNA的5392个靶基因,通过GO分析发现它们富集于生物过程、细胞成分和分子功能,通过KEGG通路分析发现主要参与几种途径,包括核糖体通路,缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路和氧化磷酸化等。通过对这些差异的miRNAs进行茎环RT-qPCR发现7个下调的miRNAs与测序结果一致,而4个上调的miRNAs中,只有miR-21a-3p与测序结果一致。【结论】由结果我们可以看出miR-449a-3p、miR-298-5p、miR-92a-1-5p、miR-423-3p、miR-423-5p、miR-128-3p、miR-340-3p和miR-21a-3p这8种miRNA验证与测序结果一致,并且这些已鉴定的miRNAs参与了不同的途径(如核糖体、HIF-1、MAPK),这些通路可能是热应激所致睾丸损伤的关键。第二部分体外实验探究miR-128-3p通过MAPK14在热激致生精凋亡中的作用及机制【目的】在第一部分基础上,发现热激后miR-128-3p下调。本实验旨在探索小鼠睾丸热激前后MAPK14活化相关蛋白的表达,验证miR-128-3p与MAPK14之间的靶作用关系并在小鼠精母细胞系(GC2-spd)中探究miR-128-3p通过调控MAPK14激活对生精细胞增殖及凋亡的影响。【方法】Western blot实验检测小鼠睾丸热激前及热激后3、6、12小时后MAPK14和磷酸化MAPK14(p-MAPK14)的表达。用几个miRNA的靶基因预测软件TargetScan、DIANA microT、miRDB、miRPath等预测miR-128-3p与MAPK14的靶作用关系。然后用双荧光素酶基因报告系统进行验证。在课题组前期建立的精母细胞热激模型基础上,优化热激条件,构建新的热激模型:即先将细胞在37℃5%CO2培养箱中培养至合适密度后,移至43℃5%CO2培养箱中热激1小时后再转回原来培养箱中继续培养。茎环RT-qPCR法检测GC2-spd细胞热激前及热激后3、6、9和12小时miR-128-3p的表达变化,并相应的用Western blot检测MAPK14和磷酸化MAPK14表达变化,以及CCK8细胞增殖检测方法检测细胞增殖活性。分别用miR-128-3p的抑制物和模拟物干扰热激前后精母细胞,然后分别用Western blot检测相应的MAPK14以及p-MAPK14的变化,CCK8细胞增殖检测方法检测细胞增殖活性以AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测法检测细胞凋亡情况。【结果】与对照组相比,小鼠睾丸热激后3、6小时p-MAPK14显著升高(p<0.001),热激后12小时差异无统计学意义(p=0.149),对于MAPK14,小鼠睾丸热激前后无明显变化。在共转染的6组中,只有共转染野生型载体与miR-128-3p mimics组荧光素酶活性显著低于其他各组(p﹤0.001),其他组间无统计学差异。GC2-spd细胞43℃5%CO2培养箱中热激1小时后,显微镜下并未见细胞出现大片死亡,与对照组相比,仅仅是形态稍变圆些。与热激前相比,GC2-spd热激后3、6小时,miR-128-3p显著降低(p<0.01),在热激后9小时恢复到热激前水平并在热激后12小时上升(p<0.01);相应的我们发现活化的MAPK形式p-MAPK14在热激后3、6小时显著上升(p<0.0001,p=0.004),并在9、12小时有所恢复(p=0.03,p=0.735);在热激后3、6、9小时,GC2-spd细胞的增殖活性降低(p=0.002,p=0.005,p<0.001),而在热激后12小时有所恢复(p=0.444)。在miR-128-3p干扰实验中,与对照组相比,单纯miR-128-3p抑制物(antagomir)组的p-MAPK14表达上升并达到了热激组水平,而在热激及miR-128-3p模拟物(agomir)组的p-MAPK14较热激组明显降低并达到了空白对照组(未热激)水平;对各组的细胞增殖活性检测发现,与对照组相比,单纯miR-128-3p antagomir组与热激组细胞增殖活性无统计学意义,但低于对照组(p<0.01),而热激加miR-128-3p agomir组细胞增殖活性显著逆转,与热激组相比明显上升(p<0.001),与对照组相比差异无统计学意义;在细胞凋亡检测实验中,单纯miR-128-3p antagomir组与热激组细胞凋亡率差异无统计学意义,但较空白对照组明显升高(p<0.001),在GC2-spd细胞热激加miR-128-3p agomir后,与热激组相比发现凋亡明显逆转(p=0.004),但未完全恢复,仍高于空白对照组(p=0.007)。【结论】小鼠睾丸热激后3和6小时,MAPK14被激活,p-MAPK14表达升高。而MAPK14为miR-128-3p的一个靶基因。GC2-spd体外热激后3、6小时miR-128-3p下调并p-MAPK14上调,体外miRNA干扰实验表明在GC2-spd热激中,MAPK通路的激活可能是miR-128-3p的下调介导的,miR-128-3p下调在GC2-spd热激后增殖抑制和凋亡中起到了很重要的作用。