猪链球菌是一种人兽共患传染病的病原菌,不仅对养猪业造成重大的经济损失,而且威胁人类健康。根据荚膜多糖的抗原性,猪链球菌被分为33种血清型,其中猪链球菌2型(SS2)被认为是毒力最强的优势菌株。1998年和2005年,在中国爆发了两次由SS2感染引起的疫情,总共导致52人死亡。因此,探究SS2的致病机理进而研发有效的防控手段是当务之急。猪链球菌在感染宿主时,会遭受各种环境压力,为适应环境的改变,菌体的特异性基因表达也会发生相应改变,这些调控机制的研究对了解猪链球菌的致病机理具有重要意义。GidA是一种tRNA转录后修饰酶,与MnmE共同参与将羧基甲基氨甲基基团添加到tRNA第34位摇摆碱基尿嘧啶上。tRNA修饰酶对于蛋白质翻译的准确性以及高效性都至关重要。在大肠杆菌中,GidA参与调控细胞分裂;在变异链球菌中,GidA参与对环境压力的适应性调节;在嗜水气单胞菌中,GidA参与调控毒力蛋白的表达;在沙门氏菌中,GidA不仅参与调控细胞分裂还影响毒力蛋白的表达;而在丁香假单胞菌中,GidA是一个全局性的调控因子,调控丁香霉素等抗生素的产量、群游现象和毒力等。本研究对SS2的GidA的结构以及在SS2致病性中的作用进行了研究,并采用iTRAQ标记的定量蛋白组学方法鉴定了SS2中被GidA调控的蛋白质,揭示了GidA发挥各生物学功能的分子机制。取得的主要研究结果如下:本研究构建了gidA基因缺失突变菌株ΔgidA,对其表型进行了研究。结果发现,gidA基因缺失后,SS2细胞的生长速度减慢,菌体的荚膜厚度增加,对小鼠的致病性显著降低。其致病性降低主要表现为溶血能力减弱、抗小鼠巨噬细胞吞噬能力减弱、对HEp-2上皮细胞黏附与侵入能力减弱、对小鼠的致死性减弱以及在宿主体内生存能力减弱。为进一步解释上述表型产生的分子机制,运用iTRAQ标记的定量蛋白组学方法比较了ΔgidA及其亲本菌株的蛋白质表达谱,共鉴定出372个差异表达蛋白,其中182个蛋白表达上调,190个蛋白表达下调。上述差异表达蛋白占全菌蛋白数量的17.02%,并且这些差异蛋白分布广泛,涉及染色体复制、重组、修复、细胞分裂、信号转导、氨基酸代谢、碱基代谢等、细菌形态、病原性等。与DNA复制、重组和修复相关的蛋白质RnmV、GyrA、Gyr B、PcrA、XerS、XerD、RecN、RmuC、RnhB,、RNase H、RNase H、RNase E和Tag全都下调表达;与细胞分裂相关的蛋白质DivIVA、FtsQ、FtsX、Fts I、GpsB、StpK、PhpP、Cps2C和MurD,除GpsB(负调控因子)和FtsX上调表达外,其它均下调表达。与荚膜合成相关的蛋白质Cps2F、Cps2P、Cps2Q、Cps2R和Cps2S上调表达,Cps2C(负调控因子)下调表达。与毒力相关的蛋白质Sly、Enolase、GAPDH、ADS(ArcABC)、DltA、GlnA、GtfA、IMPDH、PurA和SadP全都下调表达。蛋白组学结果充分解释了突变菌株表型产生的分子机制。需要指出的是,本研究虽没有获得gidA基因缺失后的互补菌株,但RT-PCR实验在RNA水平排除了敲除gidA基因可能产生的极性效应。为了从结构角度解析GidA功能的机制,本研究对GidA蛋白的结构进行了初步研究,发现GidA晶体生长出来呈细棒状,两尖端稍有分岔,但衍射后分辨率过低,结晶条件还需继续优化。上述研究揭示了GidA在SS2生长和致病性中的调控功能,为深入理解猪链球菌的生长调控机制和致病机理提供了科学依据。