糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的慢性重大疾病之一,严重影响人类健康和生活质量。胰岛素治疗是目前控制高血糖的重要手段。其中,胰岛素类似物具有结构稳定、与受体结合能力强等特点,因此在模拟正常生理胰岛素分泌及降低低血糖发生风险等方面明显优于动物、重组人胰岛素。然而,胰岛素类似物为重组基因工程产品,与传统小分子药物相比,其分子量大、结构复杂、稳定性差、批间差异大,需要一系列繁琐的分析技术,才能有效地表征其理化属性。高分辨质谱具有高质量精度及宽动态范围等优点,质谱测得的初级结构信息可以提供蛋白质分子量、氨基酸序列和大多数翻译后修饰（PTMs）的定性和定量结果。此外,在结构生物学中质谱被经常用于研究和表征蛋白质的高阶结构。将质谱用于胰岛素类似物的质量控制环节,极大地提高了该蛋白类药物质量控制的准确性,并且降低了成本,提高了效率。本论文以门冬胰岛素和德谷胰岛素为研究对象,探讨了质谱在胰岛素类似物质量控制中的应用,分别从初级结构、高阶结构以及手性杂质分析等方面进行了探索。具体研究内容如下:（1）蛋白类药物的氨基酸序列（一级结构）决定了其高级结构以及所发挥的生物学功能。本研究采用“自上而下”的序列分析策略对门冬胰岛素和德谷胰岛素的氨基酸序列及侧链非蛋白修饰序列进行了全面的分析,优化了胰岛素的还原条件及串联质谱的碰撞条件。结果表明,联合使用50 mmol/L三（2-羧乙基）膦及6 mol/L盐酸胍,在45℃下反应40 min即可充分还原胰岛素成为两条独立肽链;还原产物经Accucore C₁₈色谱柱分离,静电场轨道阱高分辨串联质谱分析,优化高能碰撞诱导裂解能量获得最为丰富的质谱碎片信息,可满足生物技术药物质量评价中100%的序列覆盖率的基本要求,亦可对问题样品提供更为全面的序列解析。此方法避免了使用传统序列分析中昂贵费时的测序级蛋白内切酶的使用,限制引入酶解修饰的风险,从而极大地节省了成本,并显著地提高了工作效率,为胰岛素类似物的序列分析和鉴别提供了一种更有效的解决方案。（2）二硫键属于蛋白质一级结构,但是对于稳定蛋白质药物的空间结构,保持其活性具有重大的作用。胰岛素类似物在合成过程中会发生二硫键错配,因此二硫键的表征对胰岛素类似物的质量控制具有重要意义。胰岛素含有链内二硫键,这会显著抑制肽链的质谱碎裂,尤其是链内二硫键所形成的肽链环内的碎裂,从而极大地限制了常规的碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞诱导裂解（HCD）等质谱碎裂手段的应用。现有的胰岛素二硫键分析方法通过部分还原结合氰基化裂解法检测到确定二硫键存在方式的关键肽段,步骤较为繁琐。为此我们采用源内碰撞诱导裂解（SID）的质谱碎裂方法,该方法有效提高环内肽链的碎裂,从而获得验证二硫键连接方式的关键质谱碎片。本研究采用酶切质谱法和SID质谱法联合解析了门冬胰岛素二硫键,验证了门冬胰岛素的三种二硫键存在方式:首先通过门冬胰岛素的Glu-C酶酶切产物验证了链间二硫键（A:C20=B:C19）,其次通过SID质谱碎片验证了链间二硫键（A:C7=B:C7）和链内二硫键（A:C6=A:C11）。本方法具有分析速度快、操作过程简单等优点,亦可推广应用于其它胰岛素类似物的二硫键分析。（3）氢-氘交换（HDX）是一种目前被广泛用于研究蛋白质高阶结构（HOS）的技术,其原理是基于蛋白质中不稳定的氢原子可与溶液中的氘交换。避免氢氘原子回交换、提高HDX实验准确性和重现性是HDX-MS技术应用的瓶颈。为此我们开发了基于固相微萃取样品靶的基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）与HDX相结合的研究胰岛素类似物HOS的方法,有效地解决了上述问题,并以高通量的方式比较了胰岛素类似物HOS的构象差异。从而实现了胰岛素类似物的快速、批量分析。此外,我们还研究了药物辅料及存储条件对胰岛素类似物的动力学和构象影响。结果表明,苯酚对门冬胰岛素注射液和德谷胰岛素注射液中六聚体的维持起到了积极的作用;过高的存放温度会影响注射液中胰岛素的HOS,导致其构象发生变化,尤其对于速效胰岛素:门冬胰岛素的影响更大些。（4）多肽药物在合成过程中容易形成消旋肽,其存在可能会影响胰岛素类似物的稳定性及生物活性。胰岛素类似物采用基因工程技术合成,首先生物合成胰岛素原,再用蛋白酶酶切去C肽得到胰岛素。由于酶切位点的限制和后续化学修饰的要求,需要化学引入氨基酸,这会引入D型氨基酸的污染,导致消旋肽的产生。我们建立了液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）检测手性氨基酸杂质的方法,并优化了消旋肽水解成氨基酸以及手性氨基酸与衍生化试剂的反应条件,显著提高了L/D-苏氨酸和谷氨酸的检出限以及线性范围,其中苏氨酸的定量检出限为2.2 nmol/L,谷氨酸的定量检出限为2.5 nmol/L。与现有的串联质谱法检测手性氨基酸杂质的方法相比,该方法对于检测同一种氨基酸的L和D型标准曲线和检出限基本一致,因此可以采用面积归一化法,根据L/D-氨基酸的LC-HRMS色谱峰面积比值直接得到两者相对含量比值,从而省去制作标准曲线的工作。