番茄(Lycopersicon esculentum Mill)属于茄科番茄属(Lycopersicon),为自花授粉作物。其营养丰富,果实中富含胡萝卜素、番茄红素、维生素C以及柠檬酸等有机酸和无机盐等。此外,由于番茄易于转化、果实大、种子多,在植物组织培养、基因工程等研究中都是重要的模式植物。番茄在生产上主要以杂交种为主,其杂种优势明显,杂种整齐度高、抗逆性强,但目前番茄的杂交制种都以人工去雄授粉的方式进行,因此番茄雄性不育系的选育显得尤为迫切和重要。T431为经多代自交选育的番茄长花柱功能型雄性不育品系,该材料在20℃以上的田间温度下可以达到95%以上的不育率,但在低温条件下(昼/夜为18℃/10℃)则花柱内缩或与花药平齐,由不育材料变为可育材料。本实验室先前已构建了T431的温敏正反向差减文库,本试验即对所得差减文库的ESTs进行了分析,并以转录辅激活因子MBF1(Multiprotein Bridging Factor 1,多蛋白桥梁因子)为研究对象,克隆其全长并作了初步的表达分析,探讨它在T431花柱发育中的作用,为最终阐明T431长花柱温敏现象的调控机制提供参考。1.本实验通过菌液PCR和反向Northern对构建的番茄T431正反向差减文库的725个克隆进行筛选,结果发现有429个克隆存在差异表达,将差异表达基因测序分析后获得了374个可利用的ESTs序列,可利用率达到87.2%。2.登陆GenBank对所得序列进行比较分析,结果显示374个可利用的ESTs序列中有324个具有蛋白编码功能,其余50个ESTs与已知蛋白质同源性较低或找不到任何同源序列。在324个具有蛋白质功能的ESTs序列中有228个序列功能己知,96个与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性。3.通过BLASTx和BLASTn对所有ESTs序列进行功能分类后,发现参与初级代谢(16%)、能量代谢(9%)、抗病与防御(12%)、信号转导(11%)等过程的基因较多,也有少数基因参与了植物体内蛋白质合成与加工、物质运输、转录调控、细胞的结构与生长发育等过程。4.选取与转录调控有关的ESTs即真核翻译起始因子(eIF-5A)、果胶酯酶(Pme)、转录辅激活因子MBF1,用半定量RT-PCR进行表达分析,发现在常温和低温条件下eIF-5A、Pme基因在T431根、茎尖生长点、叶中的表达量基本一致,说明这两个基因和T431的花柱发育的低温胁迫无关。而MBF1基因在常温下于T431的根、茎尖生长点、叶中均有表达,但茎尖生长点中表达量极低;将花芽分化期的T431经低温处理3d,6d,9d后,MBF1在根中的表达量不变;在叶中表达量低温处理初期略有增加,随后降低;而在茎尖生长点低温处理3d后,其表达量明显增加,其后随低温处理时间延长,逐渐降低,说明MBF1可能参与了花器官的形态建成,抑制了T431的花柱伸长。5.获得了一个编码转录辅激活因子基因MBF1的全长cDNA序列,命名为LeMBF1。该基因包含一个420bp的开放阅读框,编码140个氨基酸。经NCBI的BLASTx和DNAMAN软件对LeMBF1的氨基酸与其他植物MBF1蛋白进行比较,发现其氨基酸序列与马铃薯的StMBF1相似性最高,达到97%。6.从T431基因组中克隆得到MBF1的全长DNA序列,将LeMBF1的DNA序列与mRNA序列进行比较发现两者完全一致,说明该基因不含有内含子。