棉花(Gossypium hirsutum L.)是我国重要的经济作物之一,同时也是首要的纤维作物和重要的油料作物。棉花纤维是由位于子房内的胚珠外被上的表皮细胞分化发育而成的一种无分支的表皮毛(trichome)或种子表皮毛(seed hairs)。TCP转录因子是植物特异性的转录因子,参与调控植物生长发育的多个进程,例如,参与调控植物分生组织的形成以及体细胞的分化。然而,目前在四倍体棉花中很少有TCP基因调控纤维细胞发育的研究报道。本文分离鉴定了 74个非冗余的棉花TCP基因,研究了它们在棉花各组织和纤维发育各阶段中的表达模式,也采用酵母双杂交技术研究了 GhTCP蛋白之间的互作模式和GhTCP14a、GhTCP22与纤维调控因子间的互作模式,并选择在纤维伸长期优势表达的GhTCP22基因进行棉花遗传转化。另外,我们也构建GhEIN3(一个乙烯信号关键因子)的基因沉默(RNAi)、过表达和CRISPR-Cas9载体,转化棉花,获得胚性愈伤组织及转基因小植株。GhEIN3在拟南芥中过表达,能增强拟南芥对盐的耐受能力,表明棉花EIN3可能正调控植物对盐胁迫的应答。本文所获得主要结果概述如下:1.棉花TCP家族基因的鉴定及结构特征和进化关系分析根据已经公布的四倍体陆地棉基因组数据库,我们分离鉴定了 74个非冗余的GhTCP基因,分别命名为GhTCP1-A/D到GhTCP25-A/D到这些GhTCP家族成员可分为11个进化亚支(A至K),处于同一进化亚支上的成员都具有相似的保守基序分布以及相似的内含子和外显子分布。参照拟南芥TCP蛋白分类,我们将GhTCP蛋白划分为 class Ⅰ(TCP-Pclass)和 class Ⅱ(TCP-C class)两个亚家族,其中,classⅡ进一步划分为两个簇,CIN簇和CYC/TB1簇。2.棉花TCP基因家族的表达模式分析利用qRT-PCR技术对上述鉴定的陆地棉TCP基因的表达模式进行分析,结果表明,不同的TCP基因在棉花各个器官和纤维发育的不同时期存在明显的差异表达。其中一些TCP基因在棉花纤维的伸长期优势表达,这暗示着这些TCp基因可能参与调控棉花纤维的伸长发育。选取了 6个在棉纤维中特异或优势表达的GhTCP基因,分析它们在野生型徐州142和无绒无絮突变体(fl)早期胚珠中的表达模式,发现这些基因在野生型和突变体早期胚珠中的表达存在显著差异,这暗示着这些基因可能在棉花纤维起始分化过程中发挥着一定的功能。3.棉花TCP蛋白及其与纤维起始相关蛋白之间的相互作用分析为探究GhTCP蛋白在植物体内发挥功能的形式,我们利用酵母双杂交技术,对GhTCP蛋白之间的互作模式进行了分析。结果表明,大部分家族成员之间可形成同源或异源二聚体。亚家族Ⅰ的成员之间能够形成同源或异源二聚体形式发挥功能,而亚家族Ⅱ中仅有部分GhTCP蛋白能够发生相互作用。为探究GhTCP转录因子在棉纤维起始发育中的调控作用,我们检测了 GhTCP 14a和GhTCP22蛋白与一些潜在的纤维起始和伸长调控因子GhMYB2、GhMYB23、GhMYB25、GhMYB25-like、GhDEL65、GhSLR1、GhPIF3、GhARF6、GhBZR1、GhEIN3 和GhMYC2之间的互作关系。结果表明,GhTCP14a和GhTCP22能够与GhSLR1、GhARF6、GhGL3、GhMYB23、GhMYB25 和 GhTTG1 蛋白发生相互作用。另外,GhTCP14a与GhBZR1、GhEIN3和GhMYB25L也能发生相互作用。这暗示着GhTCP14a和GhTCP22可能参与到棉花纤维起始发育相关的信号调控网络。4.棉花EIN3基因表达载体构建及棉花转化本实验室在前期工作中鉴定了棉花EIN3基因,qRT-PCR结果表明GhEIN3可能在棉花纤维早期发育过程中发挥着重要的功能。为进一步研究该基因在棉纤维发育中的功能,我们构建了该基因的过表达载体,RNAi载体和CRISPR-Cas9载体,并通过农杆菌介导的棉花遗传转化,将这几个载体转入棉花中,每种载体分别获得了转基因棉花胚性愈伤组织和转基因小植株,为研究GhEIN3在棉花纤维中的功能提供了转基因棉花材料,相关的工作正在进行中。5.GhEIN3在转基因拟南芥对盐胁迫应答中发挥正调控作用将GhEIN3基因导入拟南芥,获得了GhEIN3过量表达转基因拟南芥植株的纯合株系。在黑暗条件下用ACC对其进行处理,发现GhEIN3过量表达植株的下胚轴短于野生型和双突变体ein3eill,这表明GhEIN3在拟南芥中能够响应乙烯信号。转基因pGhEIN3::GUS拟南芥中,NaCl处理能增强GUS信号,表明NaCl能诱导增强GhEIN3启动子的表达活性。同时,在NaCl处理下,过表达GhEIN3萌发率和绿苗率显著高于野生型拟南芥,表明GhEIN3能够增强转基因拟南芥植株的耐盐性。