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目的 骨髓中存在一定数量的骨髓基质干细胞（BMSCs，bone marrow stromal stem cells），这些细胞具有自我复制能力，在特定的诱导条件下能够分化为中胚层起源的组织，如骨、软骨和脂肪等。将骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，为修复重建由于创伤、感染、肿瘤等各种原因形成的组织缺损，提供了理想的治疗手段，是一项非常具有应用前景的技术。 本实验旨在通过对大鼠骨髓基质干细胞进行体外分离、培养，动态观察BMSCs的生长特点、检测细胞的表面分子抗原；观察在诱导条件下，骨髓基质干细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力；并通过观察骨髓基质干细胞对荧光色素Hoechst 33342的排出能力，评价BMSCs所处的不同分化状态，以期进一步了解骨髓基质干细胞的生物学特性，为其应用于临床提供可靠的理论依据。 实验方法 1．全骨髓贴壁培养法体外分离、培养大鼠骨髓基质干细胞，倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态及生长状况。 2．免疫细胞化学技术测定细胞表面抗原CD34、CD44、CD54、CD106的表达情况，判定所培养的细胞中有无存在造血细胞和内皮细胞的污染。 3．向生长状态良好的三代细胞中加入成骨细胞诱导液(DMEM培养液，15％胎牛血清，10mmol／L β-甘油磷酸钠，10-8M地塞米松，50μg／ml抗坏血酸)培养两周。两周后进行碱性磷酸酶染色和Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色。 4．当第3代骨髓基质干细胞达到完全融合时，加入脂肪细胞诱导液（1μg／ml胰岛素、1μmol／L地塞米松、0.5mmol／L的IBMX及10％FBS的DMEM），逐日观察细胞变化。两周后以油红O染色鉴定诱导后的骨髓基质干细胞。 5.分别取原代及第5代骨髓基质干细胞，将配制好的H加兄h吐33342工作液，加于铺满细胞的培养皿上，避光孵育30分钟，除去染液，PBS冲洗3次，OlymPusBX51荧光相差显微镜观察细胞对荧光色素H吮cllst 33342的着色强弱。实验结果 1.大鼠骨髓基质干细胞的形态学观察:骨髓基质干细胞接种后24h开始贴壁，随着时间的延长贴壁细胞数量明显增加，呈现梭形或多角形形态，经换液逐步将培养瓶中不贴壁的杂细胞清除;接种后4一sd可见较明显的集落形成，集落的形态、大小、密度各不相同;约6一sd，贴壁细胞逐渐融合成单层，细胞多呈梭形，细胞排列呈现明显的辐射状、游涡状。 原代培养4一sd时，倒置相差显微镜下可见到聚集成堆，大个、圆形，内含折光性强的脂滴的脂肪样细胞，油红0检侧为阳性。 2.骨髓基质干细胞的表型特征:免疫组织化学技术检侧BMSCs的4种表面分子表达的结果显示:BMScs的CD料（纤连蛋白和透明脂酸盐的受体）、CD54（基质受体）、CD106（细胞间钻附分子）表达阳性;而CD:抖（造血细胞系标记物）表达阴性。 3.定向诱导为成骨细胞:在诱导3一4d后，骨髓基质干细胞逐渐变得扁平，由细长梭形转变为三角形或多角形;8d时，培养细胞大部分变为多角形，细胞外基质分泌增多;第14d时，培养细胞之间出现黑色结节样结构。用钙钻法测定细胞内碱性磷酸酶活性，呈阳性反应;免疫细胞化学显示l型胶原表达阳性。 4.定向诱导成脂肪细胞:在成脂肪诱导5d，细胞原来的多角形突触逐渐回缩，但仍呈多角形;7一d时出现明显脂滴，脂滴多位于细胞边缘。诱导14d后，脂肪细胞增加，细胞内脂滴密布，多数细胞形态变圆，多散在分布。油红O染色为阳性。 5.Hoechst 33342染色结果:原代细胞进行Hh欢33342染色，紫外光激发后，可见绝大多数细胞核不着色。而第5代细胞染色后，明视场可见大部分细胞的细胞核周围都有亮晕，暗视野下，即紫外光激发后，可见细胞核大部分呈现弱着色，着色深浅不一。结论 1.大鼠骨髓中可以从分离出骨髓基质干细胞，经体外培养可以大量扩增。 2.大鼠骨髓基质干细胞在Dex、p一甘油磷酸钠和vitc作用下，可以向成骨细胞分化。 3.大鼠骨髓基质干细胞在胰岛素、Dex和IBMX诱导下，可以定向分化为脂肪细胞。 4.H慨bst 33342荧光染色技术在多潜能干细胞向单能干细胞转化过程中，能够准确客观的评价细胞所处的分化状态，可以作为干细胞筛选和检测干细胞功能状态的新方法。