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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染具有高慢性化、高肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生率,成为全球性公共卫生问题之一。目前尚无可用的预防性疫苗且研制难度较大。筛查HCV高危和易感人群,及早发现并积极治疗,并深入研究HCV感染慢性化转归的机理和相关的治疗方案列入了国家重大传染病防治内容。HCV 编码的 10 种病毒蛋白(Core,E1,E2,p7,NS2,NS3,NS4A,NS4B,NS5A and NS5B)中,HCV核心蛋白(HCV Core,Core,C蛋白)参与HCV组装和宿主机体内的一系列生化过程,与HCV感染慢性化及HCC的发生发展密切相关。HCV F蛋白是在HCV自然感染过程中由编码HCV Core基因的核苷酸密码子移位而产生的,它的表达可能与Core蛋白的表达有密切相关,而且可能发挥与Core蛋白相似的调控作用。DNA甲基化是表观遗传学修饰的一个重要途径,它是由DNA甲基转移酶(DNA methyl-transferase,DNMT)催化 S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl methionine,SAM)作为甲基供体,将CpG岛中的胞嘧啶(cytosine,C)转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应。DNA甲基化后细胞的基本遗传信息不变,但仍参与基因转录、抑制、基因表达与调控。近年来,在多项与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)、HCV感染疾病相关的表观遗传学研究中,相继发现了一系列与疾病显著相关的DNA甲基化异常现象,为疾病进展的诊断和预后提供了有力的参考依据。研究发现,比较正常肝组织与HCV相关性肝癌的肝组织活检中,应用甲基化荧光检测的方法来分析多种基因的甲基化,其中多发性腺瘤样息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)基因在恶性肝组织中较正常肝组织中的甲基化水平明显增加。研究报道Core蛋白能够通过影响甲基转移酶的表达,参与基因甲基化的调控,从而影响基因甲基化水平变化,参与疾病的发生与发展。F蛋白是由Core基因移码突变产生,可能存在与Core蛋白相同的甲基化调控作用。为探讨HCV F蛋白和APC基因甲基化在HCV感染慢性化中的关联性,本研究收集慢性 HCV 患者(chronic hepatitis patient,CHP)血样,ELISA 检测 F抗体阳性率,并依据检测结果分成2组[F-Ab(+)CHP组、F-Ab(-)CHP组],收集健康者血样作为对照组。分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),分别用HCV Core/F蛋白刺激,72h后,分别提取DNA,用二代测序检测APC基因的甲基化水平,分析各组APC基因甲基化程度的差异。初步试验结果显示,APC基因甲基化程度在F-Ab(+)CHP组、F-Ab(-)CHP组及健康对照组三组间差异有统计学意义,F-Ab(+)CHP组APC基因甲基化程度高于F-Ab(-)CHP组,健康对照组最低;三组样本PBMC分别经Core/F蛋白体外刺激后,APC基因甲基化程度总体比较差异均有统计学意义。与空白对照相比,Core蛋白与F蛋白共刺激组细胞APC基因甲基化程度高于F蛋白刺激组,Core蛋白刺激组为最低。同时收集各组研究对象的血清,检测细胞因子IFN-y和IL-5。另收集各组研究对象PBMCs经不同抗原(Core/F蛋白)刺激72h后的培养上清,进行细胞因子IFN-y和IL-5的定量检测。结果显示,在HCV患者血清IFN-y水平显著低于健康对照组,IL-5水平显著高于健康对照组。各组体外培养PBMCs IFN-y水平因刺激性抗原的不同呈现较大差异,Core+F蛋白为最强刺激抗原,HCV患者PBMCs IFN-y显著低于未经刺激的空白对照,健康对照组无显著性差异。Core和F蛋白对IFN-y的表达均为抑制作用,F蛋白的抑制作用弱于Core蛋白。各组体外培养PBMCs IL-5水平因刺激性抗原的不同也呈现较大的差异。Core+F蛋白为最强刺激抗原,HCV患者PBMCs中IL-5水平显著高于未经刺激的空白对照,健康对照组无明显差异。Core与F蛋白均能增加HCV患者PBMCs IL-5的表达量,但无明显统计学意义。Core与F蛋白对健康对照者PBMCs IL-5无明显作用。实验结果表明,Core和F均能抑制HCV患者PBMCs IFN-γ表达,促进IL-5表达;在健康对照组中,Core和F对IFN-γ及IL-5水平的影响均不明显。为进一步探究APC基因单个位点甲基化水平的变化与HCV感染转归的关联性,本研究采用病例-对照、病例-病例的分子流行病学研究方法,采集156例慢性HCV患者、55例HCV自限清除患者和66例健康对照共三组人群新鲜EDTA抗凝全血,提取DNA,二代测序检测APC基因甲基化水平,利用软件对APC基因进行CpG岛查找选择检测片段,分析各组APC基因片段中单个位点甲基化程度的差异,从而筛选出与HCV感染慢性化转归相关的特异性位点。实验结果表明,在APC基因两个目标片段中,APC M1上的rs1 12073406位点以及APC M2上的rs112043397位点的甲基化水平在健康对照、自限清除、持续感染三组间差异具有统计学意义。APC M1上rs1 12073406位点和APC M2上rs1 12043397位点甲基化水平在慢性HCV患者和健康对照者之间、持续感染组和健康对照组、自限清除组和健康对照组之间具有显著性差异;但在持续感染组和自限清除组之间无显著性差异。表明APC基因中rs1 12073406和rs1 12043397位点的甲基化水平与HCV易感性有显著关联,但与HCV感染转归无明显关联性。本研究基于中国汉族人群的遗传背景,从群体和分子水平初步探讨了 HCV F蛋白、APC基因甲基化在HCV感染慢性化转归中的作用及其相互关系,为进一步开展个性化的HCV感染的预防和治疗提供理论依据和临床研究资料,对于HCV感染的预防和临床治疗具有重要的意义。