据最新统计，目前国内大约有100万名终末期肾病患者，并以每年50-100/100万的发生率在增长，而肾移植是治疗肾衰竭的最有效的方法，但发生排斥反应是导致肾移植失败的主要原因，因此免疫抑制剂能否合理应用成为左右肾移植预后的关键。　　 他克莫司(tacrolimus，FK506)是目前防治肾移植术后免疫排斥反应的一线免疫抑制剂，然而治疗窗窄、药动学个体差异大一直是困扰该药临床用药的难题。目前临床上虽然进行常规的治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)，根据血药浓度来调整用药剂量，但其最大的弱点是滞后性，部分患者在监测前就出现血药浓度过低或过高导致的不良反应，这对于移植术后初期的患者尤为危险。因此找出他克莫司药动学个体差异大的产生原因，实现他克莫司的个体化应用，才是解决该问题的关键。　　 同时，他克莫司价格昂贵，终身服用给患者造成了沉重的经济负担，因此也制约了它的使用，地尔硫卓常作为其节约剂在临床上配伍使用，而我们在临床观察中也发现合用中药护肝药五酯片(每片含五味子酯甲7.5 mg)能显著提高他克莫司浓度，有望成为新一代的节约剂。因此，如能从遗传药理学与合并用药两个方面考虑他克莫司的个体化用药，以制定他克莫司的剂量预测方程，将有可能实现他克莫司安全、有效、经济的个体化用药。目前国内外仍未有类似的报道。　　 多年的研究表明20％～95％的药物反应和处置的个体差异是由遗传因素引起的。目前国内外有关他克莫司的个体化用药研究主要集中在药物代谢酶(CYP3A4、3A5)及转运蛋白(P-gp，由MDR1基因编码)的遗传多态性上，然而目前结论比较一致的只有CYP3A5*3与他克莫司浓度密切相关。虽然CYP3A4*1B也被证明与他克莫司药动学相关，但是中国人群中并未发现该突变，因此该突变不可能是造成中国人他克莫司药动学差异大的主要原因。而MDR1基因多态性的影响则仍无定论。CYP3A4*1G是新近发现的在中国人群CYP3A4基因中发生频率最高的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，国内有研究发现其与CYP3A4酶活性升高相关，因此该位点也可能与他克莫司药动学相关。　　 此外，近年来，核受体作为关键的转录调控因子在药物代谢酶及转运蛋白的表达调控中所起的重要作用逐渐被认识。其中，孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR，由NR1I2基因编码)被发现能同时调控CYP3A4/3A5、MDR1的表达。因此NR1I2的基因多态性也可能通过影响CYP3A4/3A5、MDR1的表达从而间接影响他克莫司的药动学。　　 目前国内外有关CYP3A4、CYP3A5、MDR1的基因多态性的特点和发生频率的研究较为系统，在不同种族都有较为详尽的报道。但对于NR1I2基因多态性目前只有针对非裔美国人和高加索人的研究资料，无完善的亚洲人/中国人的相关研究，而且从目前的研究结果可知NR1I2的突变种族差异极大。　　 综上，本课题将首先对中国健康人群NR1I2基因的SNP进行筛查，并对位于关键区域的SNP进行功能研究，随后将根据文献与本课题前期研究结果确定在肾移植患者中各个基因待研究的位点，通过回顾性研究综合分析CYP3A4、CYP3A5、MDR1、NR1I2的基因多态性及合并用药(地尔硫卓、五酯片)与他克莫司浓度的关系，筛选出有统计学意义的影响因素，建立剂量预测方程，并通过临床应用进行验证，希望能在首次给药前制订出最适合该患者的给药方案，使血药浓度尽早达到治疗窗，从而降低患者由于多次剂量调整导致浓度波动而产生的风险，实现他克莫司的个体化应用。　　 第一部分PXR/NR1I2基因多态性研究　　 目的：　　 研究中国健康汉族人PXR/NR1I2的基因多态性，并对位于关键调控区域的SNP进行功能研究。　　 方法：　　 采用PCR-直接测序法，对NR1I2基因的5UTR、3UTR、各外显子及近端内含子的已知与未知的SNP进行筛查i采用报告基因的方法检测两个位于启动子关键调控区域的SNP的功能。　　 结论：　　 中国健康汉族人群的NR1I2基因中共发现16个SNP，其中位于NR1I2基因启动子关键调控区域的A-24622T与C-24446A能使自身转录表达增强。中国健康汉族人群NR1I2的SNP的种类及发生频率与高加索人及非裔美国人存在显著的种族差异。　　 第二部分全血中他克莫司的LC/MS/MS分析方法的建立与肾移植患者药动学研究　　 目的：　　 建立并验证他克莫司的质谱检测方法，并应用于肾移植患者药动学研究中。　　 方法：　　 1.建立他克莫司检测的质谱方法、液相方法及全血样本的萃取方法。　　 2.进行全面的方法学验证：包括方法的精密度、准确度、线性及最低检测限、稳定性及基质效应等。　　 3.研究地尔硫卓对他克莫司药动学的影响。　　 结论：　　 建立了LC/MS/MS分析方法检测人全血中他克莫司浓度，该方法灵敏、特异、可靠、快速，并成功应用于他克莫司-地尔硫卓药物相互作用试验。合用地尔硫卓可以提高他克莫司的浓度，并且C0与AUC0-12 h的相关性仍较好。　　 第三部分相关基因多态性及地尔硫卓与早期肾移植患者他克莫司浓度的相关性研究　　 目的：　　 回顾性研究遗传因素(CYP3A4、CYP3A5、MDR1及NR1I2基因多态性)及地尔硫卓对他克莫司浓度的影响，为实现他克莫司的个体化给药提供依据。　　 方法：　　 采用PCR-RFLP法检测CYP3A4、CYP3A5及MDR1基因多态性，采用PCR-直接测序法检测NR1 I2基因多态性，术后第七天全血谷浓度(C0)为临床TDM数据，分析各基因型及地尔硫卓与他克莫司浓度的相关性。　　 结论：　　 CYP3A5*3基因型与他克莫司浓度密切相关，且CYP3A5与CYP3A4、MDR1、NR1I2之间存在基因型相互作用。地尔硫卓能显著提高他克莫司浓度，影响程度受CYP3A5*3基因型影响。可根据CYP3A5*3及地尔硫卓构建他克莫司剂量预测方程。　　 第四部分五酯片对CYP3A5表达型患者他克莫司药动学的影响　　 目的：　　 本部分研究将以CYP3A5表达型患者作为研究对象，以地尔硫卓作为阳性对照，比较五酯片和地尔硫卓对他克莫司药动学的影响情况。　　 方法：　　 1.24例经鉴定为CYP3A5表达型的肾移植患者在服用他克莫司至两周待血药浓度到达稳态后随机分为地尔硫卓组与五酯片组，每组各12例。　　 2.在试验第1天，在给他克莫司前(0 h)和给药后0.5，1，1.5，2，3，4，6，9，12 h取血。之后合用地尔硫卓(30 mg，每天三次)或者五酯片(0.54 g，每天三次)，合用两周后(即试验第15天)进行第二次取血，取血时间点同试验第1天取血。全血中他克莫司浓度采用LC/MS/MS法检测。　　 结论：　　 五酯片能显著影响CYP3A5表达型患者他克莫司的药动学，降低他克莫司的用量，且五酯片的作用较地尔硫卓更显著。合用五酯片时他克莫司C0与AUC0-12 h相关性仍较好。　　 第五部分CYP3A5*3基因型联合地尔硫卓/五酯片干预他克莫司用药的前瞻性研究　　 目的：　　 通过前瞻性研究，验证结合CYP3A5*3基因型及地尔硫卓/五酯片预测剂量的他克莫司给药方案。　　 方法：　　 1.试验分组　　 (1)地尔硫卓组　　 肾移植患者术前进行CYP3A5*3基因型检测，CYP3A5表达型与非表达型患者各16例，随机分入试验组与对照组，试验组与对照组各含CYP3A5表达型及非表达型患者各8例。试验组合用地尔硫卓，采用方程预测剂量给药；对照组不合用地尔硫卓，采用常规剂量给药(0.05-0.075 mg/kg，bid)。　　 (2)五酯片组　　 肾移植患者术前进行CYP3A5*3基因型检测，32例CYP3A5表达型患者随机分为试验组与对照组，每组各16例。试验组合用五酯片，他克莫司每次剂量为临床最低剂量0.05 mg/kgi对照组采用常规剂量给药。　　 2.评价指标：　　 他克莫司起始剂量(仅五酯片组)、首剂他克莫司稳态谷浓度、首剂稳态谷浓度超出治疗窗的比例、达治疗窗前剂量调整次数、达治疗窗时他克莫司所需剂量、术后两周内的急性排斥发生率及术后两周(第14天)的血肌酐水平。　　 结论：　　 对于CYP3A5表达型患者，地尔硫卓方案和五酯片方案均能更准确地预测他克莫司的给药剂量，减少剂量调整次数，使谷浓度更快地达到治疗窗，同时能显著减少他克莫司的用量；且五酯片降低他克莫司剂量的作用更显著。而CYP3A5非表达型者对地尔硫卓的节约作用不敏感，验证了第三部分的发现。因而可以根据CYP3A5*3基因型成功地指导肾移植患者他克莫司的临床应用。