目的明确分枝杆菌噬菌体Leo的生物学和基因组学特征,筛选合适的结核休眠菌模型,并验证分枝杆菌噬菌体Leo和Guo1是否可用于杀灭结核休眠菌,探索其应用于结核菌潜伏感染治疗的价值。方法1.分枝杆菌噬菌体Leo生物学特征采用双层平板法制备噬菌体Leo,观察噬菌斑形态；采用终点滴定反浊法测定耻垢分枝杆菌对噬菌体Leo的耐受突变率；检测噬菌体Leo对酒精、温度的耐受性及在不同pH下的裂解能力；通过体外杀结核分枝杆菌实验,明确噬菌体Leo对结核分枝杆菌的杀灭作用。2.分枝杆菌噬菌体Leo基因组学特征提取噬菌体DNA,限制性内切酶酶切分析确定其核酸类型；采用入噬菌体提取试剂盒提取噬菌体DNA,鸟枪法测序,得到的DNA序列用Phred/PhraD/Consedh软件包组装,拼接重叠群,PCR扩增重叠群缺口。采用DNAStar软件包、Glimmer3.0基因预测软件、Promoter prediction/Prokaryotic程序进行基因成分分析,基因功能预测,启动子区预测,对Leo作共线性分析及构建系统进化树,同时利用Clustal X软件分析Leo的motif 3基序。3.分枝杆菌噬菌体对结核休眠菌杀菌作用的初步探讨3.1结核休眠菌模型比较初步研究利用缺氧因素构建缺氧模型；利用低氧(5%O2)、高C02(10%C02)、弱酸(pH 5.0)及营养缺乏(10%7H9液体培养基)多种因素构建多因素模型。分别在第20、30天时取样,用金胺O-尼罗红染色法染色,在共聚焦显微镜下观察结核菌脂质聚集及失去抗酸性的情况；用电镜观察结核菌细胞壁增厚情况；并检测其对利福平的耐药率。在建模30天时,将等量的两种模型分别转入新鲜7H9液体培养基中,观察并比较其自动复苏情况。分别将缺氧模型建模11月及多因素模型建模53天的菌液加入罗氏培养管中,做可培养性检测。3.2分枝杆菌噬菌体对结核休眠菌的杀菌作用利用缺氧因素构建结核休眠菌模型,并将建模时间延长至一年以上；利用缺钾因素构建缺钾模型,建模时间为35天；分别将两模型菌液随机分为5组,分别加入异烟肼(终浓度5μg/mL),利福平(终浓度5μg/mL),噬菌体Leo(滴度2.6×108PFU/mL),噬菌体Guol(滴度3.26×108PFU/mL),空白组加入等量ddH2O,共培养7天后行MPN法计数,培养15天后刃天青显色记录结果,推算细菌浓度。结果1.分枝杆菌噬菌体Leo生物学特征Leo噬菌斑圆形透明,边缘清晰；耐受突变率为10-7。Leo对温度、酒精敏感,在pH 7.4和pH 5.0时均能裂解宿主菌。Leo作用于结核分枝杆菌72h后,Leo组菌量明显低于空白组(P<0.05)。2.分枝杆菌噬菌体Leo基因组学特征Leo基因组能被限制性内切酶HindⅢ、BglⅠ切开,全长39 981bp,GC含量66.86%,含3个可能的启动子区,不含串联重复序列和tRNA区。Leo含59个基因,gene32编码整合酶,不含编码阻遏蛋白的基因和不利基因,Leo与BPs和Angel相似性最高,噬菌体Leo含有motif3基序。3.分枝杆菌噬菌体对结核休眠菌杀菌作用的初步探讨3.1结核休眠菌模型比较初步研究在建模20天时,两模型组细菌均出现脂质聚集及失去抗酸性,无明显差异。两模型组细菌均未出现明显细胞壁增厚。在建模30天时,多因素模型组细菌几乎都表现出脂质聚集及失去抗酸性,而缺氧模型组仍有部分细菌未表现出脂质聚集及失去抗酸性。同时,多因素模型组在建模30天还出现了细胞壁增厚的细菌,缺氧模型组则无明显改变。多因素模型组细菌对利福平的耐药率明显高于缺氧模型组,且多因素模型组细菌自动复苏的菌量远小于缺氧模型组。但两模型均不能使所有结核菌达到不可培养状态。3.2分枝杆菌噬菌体对结核休眠菌的杀菌作用当作用于缺氧模型诱导的休眠菌时,噬菌体Leo对结核休眠菌无杀灭作用,噬菌体Guol对结核休眠菌有明显的杀灭作用,细菌量减少了3个数量级以上。而当作用于缺钾模型诱导的休眠菌时,噬菌体Leo可完全杀死结核休眠菌,而噬菌体Guo1仅能杀死一部分结核休眠菌。结论分枝杆菌噬菌体Leo是一株不含不利基因,含motif3基序的裂解性噬菌体,对结核分枝杆菌有较强的裂解能力。比较缺氧模型和多因素模型发现,多因素模型可使结核菌更快进入休眠状态,且更稳定。但后期研究发现这两种模型诱导的结核休眠菌休眠深度均不如缺钾模型。同时,分枝杆菌噬菌体Leo和Guo1对结核休眠菌均有有裂解潜力,在潜伏结核感染的治疗方面有较大潜能。