甲氧滴滴涕(methoxychlor,MXC)是一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂,因其杀虫效果明显,生物毒性相对较低,在许多国家得到广泛应用。但由于大规模的使用,加之甲氧滴滴涕所具有难降解性、生物聚积性和沿食物链传递的特性,使其所造成的环境污染已遍及全球生态系统。在土壤、河流、动植物体内、人体体液、甚至孕妇血液、胎盘、脐血、新生儿体内、乳汁中都检测到了甲氧滴滴涕。动物实验研究发现MXC具有不孕、流产、诱导卵泡闭锁等生殖毒性。因此,研究MXC对生殖细胞的影响具有重要意义。而有关MXC对体外卵母细胞成熟和受精及胚胎发育的影响的报道却很少。我们的研究以昆明白小鼠未成熟卵母细胞为研究对象,采用体外成熟、体外受精及早期胚胎发育培养的方法研究不同剂量甲氧滴滴涕对卵母细胞成熟、受精和早期胚胎发育的影响。研究目的:1研究MXC对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟的毒性作用2.研究MXC对小鼠成熟卵母细胞体外受精的毒性作用3.研究MXC对小鼠早期胚胎发育的影响第一部分甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外成熟的毒性作用研究方法:1、超促排卵得到未成熟小鼠卵母细胞。实验组MXC浓度分别为7.25,14.5,29μg/mL;对照组直接用M2培养液培养,各组培养时间均为24 h。培养过程中在倒置显微镜下观察各组生发卵泡破裂(GVBD)和第一极体(PB1)的形成情况,出现PB1的卵母细胞视为核成熟(MⅡ期)。2、激光共聚焦观察有丝分裂纺锤体的形成。3、将出现PB1的卵母细胞进行荧光染色,观察皮质颗粒的分布,判断核成熟卵母细胞胞质成熟情况。4、镜下观察MXC对卵丘扩展的影响。研究结果:1、培养24 h时,甲氧滴滴涕各处理组与对照组卵母细胞GVBD发生率差别无统计学意义(P>0.05);培养过程中GVBD发生实验组较同期对照组也没有明显延迟。但是成熟率却从71.2%(对照组)逐渐降低至22%(29μg/mL MXC组),7.25μg/mL MXC组(52.8%)和14.5μg/mL MXC组(44.4%)与对照组比较差别也有统计学意义。2、实验组较对照组MⅠ期纺锤体星体变小。3、MⅡ期卵母细胞皮质颗粒呈单层状排布于细胞膜下的比例实验组和对照组差异不显著(P>0.05)。MXC对核成熟的卵母细胞胞质成熟影响不明显。4、MXC能抑制卵丘扩展,且随着MXC浓度的升高,卵丘扩展程度明显减弱。研究结论:1、甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞的毒性作用,通过抑制卵母细胞胞核成熟,使小鼠卵母细胞成熟率明显下降,从而使母体的受孕能力下降,导致不孕。2、甲氧滴滴涕可直接作用于卵母细胞,使卵母细胞有丝分裂纺锤体形成异常,从而抑制卵母细胞核的成熟。3、甲氧滴滴涕可能通过抑制卵丘细胞的扩展,来影响后续胚胎发育,造成流产等。但对皮质颗粒的分布影响不明显,即甲氧滴滴涕不能抑制核成熟卵母细胞的胞质成熟。第二部分甲氧滴滴涕对小鼠卵母细胞体外受精和早期胚胎发育的影响研究方法:1、将7.25和14.5μg/mL MXC组核成熟的小鼠卵母细胞行体外受精,观察卵母细胞的受精能力。2、将受精卵吸出培养,每日在显微镜下观察胚胎发育情况,分析受精卵的2-细胞形成率、4-细胞形成率、8-细胞形成率、桑椹胚率、囊胚率和胚胎孵化率。3、选择形态较好的囊胚进行胚胎细胞染色计数。研究结果: 1、7.25μg/mL MXC组与对照组小鼠受精卵的受精率,2-细胞形成率、4-细胞形成率、8-细胞形成率差别无统计学意义(P>0.05); 14.5μg/mL MXC组与对照组小鼠卵母细胞的受精率,2-细胞形成率、4-细胞形成率差别不明显,但8-细胞期形成率在两组间差异显著(P<0.05),且细胞停止于此期不再分裂。2、与对照组相比,7.25μg/mL MXC显著降低小鼠囊胚形成和胚胎孵化(P<0.05),结果有统计学意义。3、7.25μg/mL MXC与对照组囊胚期细胞数差别无统计学意义(P>0.05)。研究结论:虽然甲氧滴滴涕对体外成熟的小鼠卵母细胞的受精率、2-细胞形成率的影响不明显,但是却能显著降低囊胚的形成率和鼠胚孵化率,尤其是鼠胚孵化率下降明显,从而导致流产和不良妊娠结局。