结核分枝杆菌作为结核病的病原微生物,很早就引起了人们的关注,并对其进行过大量的研究。结核分枝杆菌内存在着数量众多的转录调控因子,组成庞大的基因调控网络及次级调控网络,调控着不同基因在不同生理条件下的表达水平,使菌体能够适应环境变化而维持正常代谢,从而可能成为药物设计的靶标。结核分枝杆菌中转录调控因子的作用目前研究的还不是很清楚,其中Rv3295蛋白隶属于TetR转录调控家族,TetR家族参与了细菌的新陈代谢,小分子物质的运输,抗生素的产生等多种生理过程,具有重要调控作用。本研究以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出683 bp的rv3295基因,经限制性内切酶NdeΙ和XhoΙ双酶切后,克隆至表达载体pET-22b中,构建pET22b-rv3295重组质粒,并将测序正确的阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。该重组蛋白在终浓度1 mmol/L IPTG于30℃条件下诱导并获得了可溶性表达。经SDS-PAGE电泳分析呈现出了一个分子量为25 ku的蛋白条带,与预期蛋白大小相符。并通过亲和层析纯化,获得较高纯度的Rv3295蛋白,然后经Western-Blot分析验证,结果表明成功表达了带有His标签的重组蛋白。以该重组蛋白为免疫原,免疫BALB/C小鼠,利用细胞融合、克隆和筛选等技术,获得1株抗Rv3295重组蛋白的单克隆抗体Rv3295-1F7。采用Western blot验证抗体的特异性,通过亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型,结果显示该抗体重链为IgG1,轻链为κ链,可用于后期对Rv3295蛋白功能及应用研究。应用噬菌体随机肽库对Rv3295-1F7单抗进行3轮生物淘选,得到25株阳性噬菌体。测序结果表明:6个噬菌体序列为LTIHMDNHGPHR,2个噬菌体序列为SWFGATGVGPHR。这分别与结核分枝杆菌Rv3295蛋白的氨基酸序列18-29位和107-119位氨基酸有一定的相似度。噬菌体竞争抑制试验与ELISA方法证实,筛选出的噬菌体多肽的空间构像和天然抗原表位相似,可用于检测结核分枝杆菌及相关表位疫苗的研究。