尿液蛋白质组学在IgA肾病激素治疗前后的比较

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目的:研究初次诊断为IgA肾病(Immunoglobulin A nephropathy)患者应用激素治疗前后尿液蛋白质质谱特点,筛选出IgA肾病患者可能的差异性蛋白;同时对激素的疗效进行评估,探讨尿蛋白质组学对疾病动态监测的意义。方法:留取健康人(n=6)、新诊断为IgA肾病并满足应用激素治疗的患者(n=6)激素治疗前后(应用激素治疗1个月后)的空腹状态下清洁中段晨尿标本,为避免细菌滋长和蛋白质酶解于1小时内放置于-80℃冰箱保存备用。首先取出18份尿标本,待常温下完全溶解后将样品放于离心机中,以4℃1500g×10minutes离心,取上清以去除尿液中的细胞碎片,然后将所取上清以4℃10000g×10minutes再次离心沉淀,以去除尿液中的其他微粒,取上清,用-20℃预冷过的有机溶剂(有机溶剂为乙醇与丙酮按体积1:1配制)按照标本体积与有机溶剂体积比为4:1进行蛋白质沉淀,置于-20℃过夜后,经4℃25000×g离心30分钟,弃上清液,将含尿液蛋白质的沉淀物真空干燥浓缩并存于-20℃待用。浓缩干燥的尿蛋白沉淀物用磷酸盐缓冲溶液(PBS)充分溶解后,用考马斯亮蓝染色法(Bradford)测定每份样品中尿蛋白浓度,称取每例样品含1mg蛋白质的混合固体,充分溶解后使用高效液相色谱法(C18吸附柱)除盐,测的肽峰,获取峰面积及含肽的混合溶液,真空干燥,最后将干燥后的样品充分酶解,并将个样品的的蛋白浓度调整为1μg/μl后进行HPLC-ESI-MS/MS分析,获得的尿液蛋白质多肽序列应用Mascot Daemon软件进行数据检索,应用库为ipi_hunman_v3.71_reverse.fasta,所获得的人尿蛋白序列号在Uniprot数据库中检索,查询目标蛋白质的名称、作用等相关信息。结果:1.6份健康人的尿液样品中共鉴定出98种蛋白质,经手工验证后,所有健康人的尿液样品共同表达29种蛋白质;2.6份新诊断为IgA肾病患者激素治疗前的尿液样品中共鉴定出165种蛋白质,所有IgA肾病患者激素治疗前的尿液样品共同表达11种蛋白质;将这11种蛋白质与健康人尿液所表达的蛋白质进行比较,从中手工剔除相同蛋白质,特异性表达10种蛋白,它们是:免疫球蛋白重链v-iii区(Ig heavy chain V-III region TEI)、Igγ2链C区(Ig gamma-2chain C region)、 а-1抗胰糜乳蛋白酶(Alpha-1-antichymotrypsin)、а-1抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin)、维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein)、血红蛋白β链(Hemoglobin subunit beta)、免疫球蛋白IgG轻链(IGL@protein)、血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)、IGK@protein、Anti-(ED-B) scFV和血清铁传递蛋白(Serotransferrin)结论:1.本实验利用HPLC一ESI一MS/MS技术研究了IgA肾病患者的尿液蛋白质谱特点,共得到165种蛋白质,并与健康人尿液中表达的蛋白进行比较,手工剔除相同的蛋白质,IgA肾病患者尿液中特异性表达的蛋免疫球蛋白重链v-iii区(Ig heavy chain V-III region TEI)、Igγ2链C区(Ig gamma-2chain C region)、а-1抗胰糜乳蛋白酶(Alpha-1-antichymotrypsin)、 а-1抗胰蛋白酶(Alpha-1-antitrypsin)、维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding protein)、血红蛋白β链(Hemoglobin subunit beta)、免疫球蛋白IgG轻链(IGL@protein)、血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)、IGK@protein、Anti-(ED-B) scFV和血清铁传递蛋白(Serotransferrin)可能成为IgA肾病的生物标志物。2.每例IgA肾病患者自身尿液在使用激素治疗前后进行比较,发现尿液中蛋白的种类略有减少。
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