辣椒疫霉菌诱导的辣椒CaRGA1和CaPOD基因的表达分析与功能鉴定

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jeanndy
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辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的蔬菜作物,具有极高的经济价值,在全世界范围内广泛栽培。然而,辣椒的病虫害却日益加重。尤其是以辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的疫病(Phytophthora blight),现已成为制约辣椒产业化发展的主要因素之一。人们采取各种方法来防治疫病的发生,但是效果不明显,甚至造成农药残留物超标的严重后果。因此,利用分子生物技术开展抗病育种具有很重要的现实意义。本研究探讨了辣椒与P. capsici亲和与非亲和的互作防御机制,建立了辣椒的病毒诱导基因沉默(VIGS)优化体系,利用VIGS结合转基因技术对辣椒基因CaRGA1和CaPOD的功能在辣椒上进行了鉴定,并在此基础上利用第二代高通量测序技术对辣椒与不同亲和组合P. capsic i互作的转录组进行测序分析,旨在为以后的辣椒抗病育种提供理论依据。主要研究成果如下:1.探讨了辣椒与不同亲和组合辣椒P. capsici互作过程中的防御机制。主要包括:防御相关酶(β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶)活性的测定以及防御相关基因(CABPR1、CABGLU和CAPO1)的表达模式分析。结果表明,不同亲和组合辣椒P. capsici中防御酶活性高低及变化趋势不一致;实时定量RT-PCR分析认为,不同亲和组合中防御相关基因的表达模式不同,叶片中的表达量明显高于根系中,非亲和组合中的表达也明显高于亲和组合。2.建立了辣椒的VIGS优化体系。在前人研究的基础上,以辣椒的八氢番茄红素脱氢酶基因CaPDS为阳性报告基因,构建了重组病毒沉默载体pTRV2-CaPDS;利用农杆菌注射法,对影响沉默效率的主要因素:不同品种(A5、A3和EC)、植株苗龄(两叶、四叶、六叶和八叶期)、接种浓度OD600(0.5、0.8、1.0、2.0和3.0)和培养温度(18、20、22、25和28℃)进行了分析,最终得到了适合辣椒的VIGS优化体系,为今后辣椒基因的高通量功能分析提供了技术支持。3.对辣椒CaRGA1和CaPOD基因进行了生物与非生物因素逆境胁迫下的表达模式分析。结果表明:在辣椒P. capsici侵染下,CaRGA1和CaPOD基因均被不同程度的诱导表达;在非生物因素胁迫处理下,CaRGA1受高盐、干旱和茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导而上调表达,但其表达却受到水杨酸(SA)的抑制,说明CaRGA1基因可能参与了MeJA的信号转导途径;CaPOD基因参与了辣椒的抗盐与抗旱反应,另外,该基因可能也与SA和MeJA介导的信号转导途径有关。4.利用VIGS技术对辣椒基因CaRGA1和CaPOD的功能进行了初步鉴定。对获得的CaRGA1和CaPOD基因沉默辣椒植株进行观察,发现沉默植株与阴性对照植株之间并没有明显的表型差异,实时定量RT-PCR结果显示基因在沉默植株中的表达有不同程度的降低;对沉默植株进行离体叶片抗病性鉴定,分别于接种后第3d和第5d在CaPOD和CaRGA1沉默植株的离体叶片上出现坏死病斑,从而初步推断出这两个目的基因的沉默降低了辣椒对P. capsici的抗性反应。5.构建了CaRGA1基因的过量植物表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法,最终获得了4株转基因辣椒植株。与阴性对照相比,CaRGA1转基因株系并没有发生表型上的变化;离体叶片接种辣椒P. capsici后,我们发现转基因株系叶片上的坏死病斑少于阴性对照植株,但是防御酶活性却明显高于对照植株活性,说明CaRGA1基因参与了辣椒与P. capsici的抗性反应过程;采用离体叶圆片法对转基因植株进行了抗盐性分析,结果表明:与转基因株系相比,阴性对照植株的叶圆片有失绿现象,有些甚至呈水渍状。叶片总叶绿素含量测定数据显示,转基因植株的叶绿素含量高于阴性对照,说明CaRGA1基因可能与辣椒的抗盐反应有关。6.构建了CaPOD基因的过量表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化法转到辣椒植株中,最终获得了6株CaPOD基因过量表达的转基因植株。通过表型观察,我们发现转基因与阴性对照植株之间没有差异;抗性鉴定结果表明:CaPOD转基因植株对辣椒P. capsici的抗性增强,而且提高了植株的耐盐力。以上结果,不仅说明了CaPOD基因在辣椒抵抗P. capsici的过程中发挥正向的调节作用,还参与了辣椒应答高盐胁迫的反应。7.利用第二代高通量Illumina/Solexa测序技术,构建了辣椒与P. capsici亲和与非亲和互作的转录组数据库。测序共获得了101,641个Unigene,其中HX-9转录组有50,795个,PC转录组有50,846个;对所获得的Unigene进行功能注释,其中33,365个Unigene被注释到NR数据库,34,658个被注释到NT数据库,20,747个比对到Swiss-Prot数据库中,18,654、11,698和27,087个Unigene分别用于KEGG代谢途径分析、COG和GO分类;在两个转录组中共找到8,144个差异表达基因,HX-9转录组中上调表达的有6,497个,PC转录组中上调表达的有1,647个;利用半定量PCR的方法对筛选出的6个候选差异表达基因进行表达分析验证,分析结果与测序结果基本一致,证明我们建立的辣椒与P. capsici互作的转录组数据库可靠,为深入挖掘辣椒疫病抗性基因及其相关基因奠定了基础。
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