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荧光假单胞菌(Pseudomonas sp. M18)是从上海郊区甜瓜根际分离筛选到的一株具有生物防治功能的假单胞菌新种。M18生防作用主要归功于其可分泌多个抗生物质,包括藤黄绿菌素(pyoluteorin,Plt)和吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic acid,PCA)等。本研究试图在分子水平上鉴定藤黄绿菌素合成相关的生物调控因子,揭示和阐明这些调控因子和藤黄绿菌素生物合成之间的关系。并以这些调控因子为靶向,构建Plt高产工程菌株,提高M18的Plt产量,增强其生物防治能力。本研究主要包括四个方面内容:第一方面,本课题组利用双元报告转座子mini-Tn5 lacZ-ter/1,筛选了若干后期菌群传感应答基因突变株。与野生型菌株相比,M46-11、M49-2和M58-17的表型具有显著变化,它们分别具有Plt不产、涌动能力降低和红色素合成能力缺失的特征。利用分子生物学的方法,鉴定和分析了相应的突变基因,证实M58-17为潜在的菌群传感突变株。研究过程中还发现,M18菌株能够分泌高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones,AHLs),其降解(M18/pME6863)或缺失(M58-17)均可以影响抗生素的产量,从而推测AHL类型菌群传感系统存在于该菌株中,并且可能介入了抗生素生物合成的调控体系。第二方面,生物信息学分析显示,藤黄绿菌素生物合成基因簇启动子区域存在一个潜在的LuxR家族蛋白作用位点(lux box),表明M18菌株中潜在的菌群传感(quorum sensing QS)系统可能直接参与了Plt生物合成的调控。基于以往遗传学分析和突变株58-17突变基因序列分析表明,假单胞菌株M18兼有荧光假单胞和铜绿假单胞菌的遗传学背景,并且部分的rhlI基因序列十分相似(相似度99%)。据此设计保守引物,扩增得到M18菌株中的rhlR和rhlI基因。序列分析结果显示,rhlR和rhlI基因及表达蛋白质序列与铜绿假单胞PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)高度相似。因此,M18菌株中的这个菌群传感系统也命名为rhl菌群传感系统(RhlR and RhlI)。庆大霉素抗性基因(Gm)插入突变株M18IG(rhlI::Gm)丧失了合成N-butyryl-homoserine lactone (BHL)和N-hexanoyl-homoserine lactone (HHL)这两种AHL信号分子的能力,但其Plt产量比野生型提高了5倍,同时抑制另一个抗生物质PCA的生物合成。卡那抗性基因(Km)插入失活rhlR基因后得到突变株M18RK(rhlR::Km),其Plt和PCA合成变化趋势与突变株M18IG相似。藤黄绿菌素pltLA’–‘lacZ翻译融合和吩嗪-1-羧酸phzA’–‘lacZ翻译融合在突变株中的表达情况表明,rhlI和rhlR在基因表达水平上调控这两种抗生素的生物合成。RhlR和RhlI组成一个有机统一的rhl菌群传感系统,参与调控Plt和PCA生物合成。随后的信号分子添加实验又证明,BHL信号分子而非HHL在该调控中发挥了主导作用。野生型菌株M18,突变株M18IG和M18RK中pltA基因的mRNA荧光定量PCR分析结果显示,突变菌株中pltA基因的mRNA水平是野生型的4至5倍。这表明rhl菌群传感系统负调控Plt生物合成基因簇的转录。rhl菌群传感系统突变菌株中,plt转录融合表达质粒pMEAZ-12的表达水平也提高了将近5倍。与此形成鲜明对比的是,另一plt转录融合表达质粒pMEAZ-13在rhl菌群传感系统突变菌株中的表达水平却和野生型菌株一致。这两个转录融合表达质粒的区别在于pMEAZ-13比pMEAZ-12少了启动子和基因编码区之间的176 bp间隔序列。这些结果进一步证明了rhl菌群传感系统在转录水平上负调控Plt的生物合成;另一方面也表明,176 bp的间隔序列是调控相关的重要位点。同时也揭示潜在的lux box在此调控过程中并不发挥所预测的生物学功能。同时,rhl菌群传感系统的突变(M18IG和M18RK)促进了ABC(ATP-binding cassette)转运基因簇pltHIJKNO的表达,而后者负责转运分泌Plt而促进Plt的产生。rhlI pltB双突变菌株M18TI和rhlR pltB双突变菌株M18TR不再合成Plt,转运基因簇pltHIJKNO在这两双突变菌株中的表达又显著降低,只有野生型水平的一半。这些结果表明rhl菌群传感系统必须以Plt为媒介,从而负调控转运基因簇pltHIJKNO的表达。第三方面,在Plt生物合成基因簇上游鉴定了一个Plt生物合成正调控因子编码基因pltR。pltR突变株M18TRG和pltR过表达菌株M18(pME6032PLTR)中Plt、PCA的产量以及Plt生物合成基因簇的转录结果表明,pltR在转录水平上对Plt的生物合成进行路径特异性的正调控。在rhl菌群传感系统突变株M18IG和M18RK中, pltR’–‘lacZ翻译融合表达增加,表明PltR表达受rhl菌群传感系统负调控,从而后者对藤黄绿菌素生物合成进行负调控。此外,pltR’–‘lacZ翻译融合在不同突变株中的差异性表达表明PltR处于Plt生物合成调控体系下游,其介导了GacA/GacS对Plt生物合成的正调控作用,但不介入RsmA对Plt生物合成的负调控作用。Plt本身也不影响pltR基因的表达。第四方面,在研究藤黄绿菌素和吩嗪-1-羧酸二者生物合成的相互关系时发现,吩嗪-1-羧酸的生物合成在转录后水平上抑制了藤黄绿菌素的产生;而后者对前者没有调控作用。不产生PCA的突变菌株M18P中添加过量PCA,并没有逆转其Plt高产的特点,从而证明了PCA分子本身不是Plt生物合成的抑制物。PCA生物合成的丧失所导致的Plt高产并不是PCA的缺失所致,而是另有它因。RT-PCA和转录融合表达实验又证明,与rhl菌群传感不同,PCA生物合成对Plt的正调控作用发生在转录后水平上,而不是转录水平上。