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AMP依赖性蛋白激酶(AMP activated protein kinases,AMPK)是一种负责代谢和能量需求的蛋白激酶,激活AMPK可以增强分解代谢(脂肪酸氧化和糖酵解等),而且这一激酶也是细胞响应代谢压力时调节细胞内能量稳态的关键分子。睾丸支持细胞(Sertoli cels,SCs)的代谢具有“瓦尔堡效应”,即使在氧气充足的情况下也能通过高速的糖酵解将葡萄糖转化为乳酸,并产生ATP。睾丸支持细胞分泌的乳酸不仅是生精细胞发育的首选能量底物,而且在精子形成过程中还具有抗凋亡的作用。猪睾丸支持细胞内乳酸的分泌受到GLUT3(glucose transporters 3,葡萄糖转运载体3)、LDHA(lactate dehydrogenases A,乳酸脱氢酶A)和MCT1(monocarboxylate transporter 1,单羧酸转运蛋白1)的调控。本试验室的前期研究发现热应激(43°C,30 min)能够促进支持细胞中乳酸的分泌;越来越多的证据显示,热应激改变了多种组织和细胞中AMPK的活性,但是热应激是否可以通过调节AMPK活性影响睾丸支持细胞中乳酸生成目前还不清楚。因此,本文首先研究了热应激处理后仔猪睾丸支持细胞内AMPK活性的变化,然后利用AMPK激活剂和过表达模型分析AMPK在乳酸分泌中的作用,并分析了AMPK对乳酸合成量以及相关蛋白GLUT3、LDHA和MCT1 mRNA和蛋白的表达以及LDH酶活的影响。本研究以3周龄左右的仔猪睾丸作为试验材料,首先用43°C培养箱对体外培养的支持细胞进行30 min的热处理,然后将热处理的细胞放回32°C培养箱,分别培养0 h,3 h,6 h,12 h,24 h和48 h(热应激后恢复处理),利用RT-PCR检测乳酸分泌相关基因的表达,运用western blot检测细胞中AMPK的磷酸化水平和乳酸分泌相关蛋白的表达,收集培养液用乳酸检测试剂盒进行乳酸分泌量的测定,以确定适宜的恢复时间。在此基础上,用AMPK的激活剂AICAR或转染AMPK过表达载体,然后热处理细胞,利用western blot检测AMPK的磷酸化水平以及乳酸相关蛋白GLUT3、LDHA、MCT1的蛋白表达,利用LDH酶活检测试剂盒测定细胞内LDH酶的活性,用RT-PCR检测AMPK的过表达效率及乳酸分泌相关蛋白的mRNA表达情况。试验结果如下:(1)热应激(43°C处理30 min)后,培养的仔猪睾丸支持细胞分泌的乳酸量增加,伴随着恢复时间的延长而增加,在12 h达到最大值,与对照组相比增加了75%(P<0.01)。(2)热应激后支持细胞内AMPK磷酸化水平降低,且呈时间依赖性。随着恢复时间的延长而减少,在12 h降到最低,是对照组的58%(P<0.01)。随后又逐渐恢复,在48 h已达到正常水平。(3)AMPK激动剂AICAR(2 mmol/L,2 h)促进了AMPK的磷酸化水平(P<0.01);降低了热应激引起的乳酸分泌量增多和GLUT3、LDHA、MC T1的蛋白和mRNA的表达量增加,下调了热应激后LDH酶活的增加酶活的增加(P<0.01)。(4)转染AMPK过表达载体pcDNA-AMPK能显著提高AMPK mRNA的表达量,与对照相比增加了2.34倍(P<0.01);然而空白载体pcDNA单独作用却对AMPK蛋白和mRNA的表达量并无显著影响(P>0.05)。(5)pcDNA-AMPK降低了热应激引起的乳酸分泌量增多和GLUT3、LDHA、MCT1的蛋白和mRNA的表达量增加以及下调了热应激后LDH酶活的增加(P<0.01)。总之,热应激降低了睾丸支持细胞中AMPK活性,降低AMPK的活性促进了支持细胞内乳酸的分泌。AMPK活性下降则上调了乳酸分泌相关基因和蛋白GLUT3、LDHA、MC T1的表达并增加了LDH酶活,促进了乳酸的分泌。因此,AMPK是热应激诱导支持细胞内乳酸分泌增加的负性调控因子,下调支持细胞中AMPK活性是增加睾丸中乳酸分泌,抑制生精细胞凋亡的有效途径。