苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase, MDH）催化L-苹果酸与草酰乙酸之间的可逆转换，参与细胞内三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA）、乙醛酸循环（glyoxylate cycle）、苹果酸/天冬氨酸穿梭（malate-aspartate shuttle）以及光合作用（photosynthesis）中的CO₂固定等重要代谢途径。系统发生分析显示，MDH可以分为三类，即细胞质型同源二聚体MDH、线粒体型同源二聚体MDH以及类似于乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）的同源四聚体MDH（LDH-like-MDH）。根据辅酶依赖性的不同，MDH可以分为NAD⁺依赖型MDH （NAD-MDH）和NADP⁺依赖型MDH （NADP-MDH）。研究显示，除叶绿体MDH和极少数古菌MDH为NADP-MDH外，目前发现的其它所有MDHs均为NAD-MDH。尽管NAD⁺和NADP⁺在化学结构上十分相似，但在代谢中却起着截然不同的作用：NADH参与分解代谢提供细胞生长所需的能量，而NADPH主要参与合成代谢为生物合成提供还原力，维持细胞生长。因此，不同辅酶依赖性的MDH在细胞内的功能是不同的。通过NAD-MDH与叶绿体NADP-MDH的氨基酸序列以及空间结构比对，本研究将Escherichia coli野生型NAD-MDH （EcMDH）中NAD⁺结合位点的若干关键氨基酸定点突变为叶绿体NADP-MDH中相应的结合辅酶NADP⁺的氨基酸，构建了G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷、G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷A⁷⁹及G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷G⁷⁹三个突变体酶。酶动力学实验显示，3个突变体酶都实现了辅酶特异性的转换，即由NAD⁺依赖性酶转变为NADP⁺依赖性酶。其中突变体酶G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷A⁷⁹对NADPH的特异性是NADH的28倍，也是野生型EcMDH对NADPH特异性的4.1×10⁴倍。为了鉴定不同辅酶依赖性MDH对E. coli生长的影响，本研究通过染色体同源重组技术，将包含NADP⁺依赖型异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase,IDH）的野生型E. coli菌株Wt (icdA^NADP/mdh^NAD)和包含突变体酶NAD⁺依赖型IDH的工程菌株Ym (icdA^NAD/mdh^NAD)染色体上的NAD-MDH基因替换为突变体酶G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷A⁷⁹基因，构建了Wt/mdh (icdA^NADP/mdh^NADP)和Ym/mdh(icd^ANAD/mdh^NADP)菌株，并分别测定了Wt (icd^ANADP/mdhNAD)、 Ym(icd^ANAD/mdhNAD)、Wt/mdh (icdA^NADP/mdh^NADP)和Ym/mdh (icd^ANAD/mdh^NADP)四个菌株以葡萄糖或乙酸为唯一碳源时的生长速率。结果表明，当以葡萄糖为唯一碳源时，Wt/mdh和Ym/mdh菌株的生长速率略高于野生型菌株。原因可能是突变体酶NADP-MDH (G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷A⁷⁹)可以产生较多的NADPH参与生物合成，从而促进了Wt/mdh和Ym/mdh菌株的生长。当以乙酸为唯一碳源时，Wt/mdh和Ym/mdh菌株的生长速率明显下降，分别只有野生型菌株Wt生长速率的28%和42%。这一结果说明NAD-MDH对于细菌在贫瘠碳源上的生长是至关重要的。通过比较4种菌株在乙酸中的生长速率，发现MDH的辅酶依赖性比IDH的辅酶依赖性对细菌生长的影响更加显著。另外可能突变体酶NADP-MDH (G³⁴S³⁵S³⁶G⁷⁷A⁷⁹)的活力较低，NADP-MDH对细胞生长的促进作用不明显。