猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要致病病原体。PCVAD主要包括包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、皮炎肾病综合征(PDNS)、呼吸道综合征(PRDC)、繁殖障碍、肠炎等。PCVAD在世界各地都很流行并对养猪业造成巨大的经济损失。然而,并非所有的感染PCV2的猪都会发展为PCVAD,饲养管理、其他病毒混合感染、营养状况和免疫刺激等一系列额外因素也被认为和PCVAD的发生紧密相关,但是,到目前为止PCV2的致病机制仍然不是很清楚。赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉菌和青霉菌的部分菌株产生的一种真菌毒素,在自然界分布广泛,包括各类谷物(玉米、小麦、燕麦、大麦)、猪肉、鸡蛋、鱼和啤酒等。由于OTA的天然来源广泛,普遍处于低水平污染以及化学稳定性,OTA污染始终存在于整个饲料供应以及食物链。自噬是受损细胞器、错误折叠蛋白等通过溶酶体途径进行降解的一种高度保守机制,在真核生物中广泛存在。一般情况下,自噬作为机体的防御机制,能够抵抗病毒的感染。但在长期进化过程中,病毒已经能够进化出多种策略来逃逸或抑制宿主细胞自噬,甚至利用自噬机制来促进自身复制。我们之前的研究表明,OTA可能是促进PCV2复制的一个重要因素,并且OTA在猪饲料中不同污染水平可能部分解释为什么PCVAD在PCV2感染猪场发病率和严重程度不同。然而,但对于OTA影响PCV2感染复制的作用机理则有待于更深入的探讨。尽管PCV2疫苗的研制取得较大的进展,但疫苗的效力具有不确定性,受抗原浓度、佐剂类型以及给药剂量等多种因素影响。而营养调控被认为是预防病毒感染的有效策略之一。富硒酵母是由本实验室研制一种新型有机硒制剂,能够作为硒的营养补充剂添加至畜禽饲料中。硒是人和动物必需的微量元素之一,具有增强机体免疫力、提高机体抗氧化性能,抵抗病毒感染等多种生物学功能。酵母是人类利用最为广泛的微生物之一,含有丰富的维生素与矿物质。酵母多糖则是酵母细胞壁的主要成分,同样具有增强免疫、促生长以及抗病毒等生物学功能,且来源广泛、成本低廉。本论文主要对OTA促进PCV2感染复制的自噬及信号通路机制、硒和酵母多糖影响PCV2感染复制的自噬机制等方面进行研究,一方面有助于猪圆环病毒病发病机制的进一步阐明,同时可以为硒、酵母多糖以及富硒酵母在畜牧生产应用提供一定科学依据。试验一、赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究赭曲霉毒素A是由曲霉菌和青霉菌产生的一种真菌毒素。猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是猪圆环病毒相关疾病的致病病原体。自噬是受损的细胞器以及长寿蛋白通过溶酶体途径降解的一个保守的代谢机制。研究发现许多病毒能够利用自噬促进自身复制。我们之前的研究报道低剂量的OTA可以在体外和体内促进PCV2复制,但其潜在机理仍需进一步研究。本研究通过检测PCV2 Cap蛋白表达、病毒毒力、DNA拷贝数以及阳性细胞感染数进一步证实OTA能够促进PCV2在PK-15细胞中复制。同时,我们通过检测自噬相关蛋白LC3、ATG5和Beclin-1的表达以及GFP-LC3的点状聚集情况发现OTA可以引起自噬反应。此外,应用自噬通量抑制剂CQ检测p62和LC3表达发现,OTA能够引起完整的自噬反应。而应用自噬抑制剂3-MA和CQ能够显著削弱OTA对PCV2的复制促进作用。通过siRNA特异性干扰自噬关键蛋白ATG5或Beclin-1能够进一步证明抑制自噬可以削弱OTA对PCV2的复制促进作用。我们的研究还发现,NAC能够阻断OTA诱导的自噬反应,说明氧化应激可能参与OTA诱导的自噬过程。我们体内的试验同样发现,与饲喂正常日粮相比,饲喂75 ug/kg或150ug/kg OTA日粮能够显著提高仔猪组织中OTA的含量,降低仔猪抗氧化性能。同时,饲喂75 ug/kg OTA日粮能够显著提高仔猪肺脏、脾脏、肾脏以及支气管淋巴结中PCV2的复制以及自噬水平。结果表明,OTA能够诱导氧化应激介导的自噬促进PCV2在体内外复制。试验二、赭曲霉毒素A诱导自噬促进PCV2复制的信号通路机制研究前一章试验结果表明赭曲霉毒素A(OTA)能够诱导由氧化应激介导的自噬促进PCV2复制,但OTA诱导自噬的信号通路机制有待深入研究。在本研究中,我们通过药物特异性抑制信号通路中不同激酶的活性,探讨其在OTA诱导的自噬反应及PCV2复制促进中的作用。结果表明,OTA能够抑制PCV2感染PK-15细胞中AKT与mTOR活性而导致自噬增强。Insulin处理能够逆转OTA引起的AKT与mTOR磷酸化水平降低,并且能够逆反OTA诱导产生的自噬反应以及PCV2复制促进作用,进一步说明AKT/mTOR信号通路在OTA诱导的自噬和PCV2复制促进中的作用。同时,OTA能够激活ERK1/2信号通路;U0126可以抑制ERK1/2的磷酸化,抑制OTA诱导的自噬反应及PCV2复制促进,说明OTA还能通过激活ERK1/2诱导产生自噬。此外,U0126还能提高OTA引起的mTOR磷酸化水平降低,说明OTA先激活ERK1/2进而抑制mTOR的活性从而诱导产生自噬。试验三、硒蛋氨酸阻断赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是猪圆环病毒相关疾病的致病病原体。我们之前研究表明OTA能够诱导自噬促进PCV2复制,同时补充适量硒能够抑制OTA对PCV2复制的促进作用。然而,其潜在的机制仍需进一步研究。本试验旨在研究硒蛋氨酸对OTA引起PCV2复制促进作用的影响及其与自噬相关的潜在机制。结果表明,0.1 μM OTA能够显著提高PCV2 Cap蛋白表达、病毒毒力、DNA拷贝数以及阳性细胞感染数。不同剂量的硒蛋氨酸(2、4或6μM)能够阻断OTA对PCV2的复制促进作用。通过Western Blotting检测LC3-Ⅱ与ATG5的表达以及激光共聚焦检测GFP-LC3点状聚集情况发现,OTA能够引起PCV2感染的PK-15细胞产生自噬反应。而硒蛋氨酸能够削弱由OTA诱导的自噬反应并且激活AKT/mTOR信号通路。应用AKT/mTOR信号通路的抑制剂雷帕霉素,能够逆转硒蛋氨酸对OTA诱导的自噬反应以及对PCV2复制促进的抑制作用。总的来说,硒蛋氨酸可以通过激活AKT/mTOR信号通路抑制自噬,进而阻断OTA对PCV2复制的促进作用。我们的研究表明添加硒蛋氨酸可能是预防PCV2感染的有效策略,自噬则可能是开发新型抗PCV2药物的潜在靶点。试验四、酵母多糖对PCV2感染小鼠的保护作用及机制研究猪圆环病毒2型(PCV2)被认为是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要致病病原体。之前研究表明,自噬在PCV2的感染复制中起着重要的作用。同时,抑制自噬能够降低PCV2的复制。酵母多糖(YSP)是酵母细胞壁的重要组成成分,研究表明YSP能够抑制多种病毒的复制,但YSP对PCV2感染复制的影响未见报道。本试验旨在研究酵母多糖(YSP)对猪圆环病毒2型(PCV2)在小鼠体内感染复制的影响及与自噬相关机制研究。将100只ICR小鼠随机分为5组:阴性对照组,PCV2感染组、YSP低剂量组(每日灌服100 mg/kg)、YSP中剂量组(每日灌服200mg/kg)和YSP高剂量组(每日灌服400mg/kg)。连续灌服YSP14 d后,给除了阴性对照组之外的4组小鼠腹腔注射2000TCID50PCV2。PCV2感染后继续灌胃给药28 d。在感染7 d、14 d、21 d、28 d分别检测血清中SOD活性、MDA水平,IL-2以及TNF-α的含量。同时还对肺脏和脾脏中PCV2的病毒量、病理学变化以及自噬水平进行检测。实验结果表明,灌服不同浓度的YSP能够显著降低小鼠肺脏与脾脏中PCV2 DNA拷贝数,以及免疫组化中Cap蛋白阳性抗原数,同时能够改善小鼠肺脏与脾脏的病理学损伤。YSP能够提高小鼠的抗氧化性能,提高血清中SOD活性,降低MDA的含量;同时YSP还能够显著提高血清中IL-2以及TNF-α的含量。此外,YSP能够降低PCV2感染小鼠肺脏以及脾脏中LC3-Ⅱ以及ATG5的表达水平。