脊髓损伤一般由于外界间接或者直接因素造成脊髓压迫甚至断裂,伴随呈现各类感觉、运动和神经功能受限,肌肉出现异常和病理性反射等变化,常会使患者出现不同程度的瘫痪,严重致残、致伤,严重影响病人的平时活动和工作能力,对家庭和社会产生深远的影响。脊髓损伤会导致大量脊髓神经元死亡,损伤部位出现水肿及缺血现象,影响神经元的再生,不利于脊髓功能的恢复。硬脊膜切开可有效减轻脊髓损伤后的水肿及缺血状况,减少脊髓空洞,保存更多神经元轴突,是一种较为理想的治疗方法。本实验旨在通过建立大鼠脊髓损伤模型,研究硬脊膜切开对脊髓损伤的治疗效果、手术时机及其治疗机制进行初步探讨。第一章硬脊膜切开、脊髓切开对大鼠脊髓损伤疗效观察目的建立大鼠脊髓损伤模型,观察硬脊膜切开、脊髓切开对大鼠脊髓损伤的疗效。方法选取成年SD大鼠65只,体重200~250g,雌雄不限。取5只打开椎板,不进行脊髓损伤,作为空白组,其余大鼠制作重度脊髓损伤模型,按随机数字表法分为硬脊膜切开组(A组),脊髓切开组(B组),模型组(C组,打开椎板损伤脊髓不手术),每组各20只。采用BBB运动功能评分法观察1d、3d、7d、14d后大鼠后肢功能恢复情况,各时间点大鼠后肢MEP波幅、潜伏期;各组脊髓含水量;TTC染色观察各组损伤区缺血面积;对损伤部位行H-E染色、NF-200、GFAP免疫组化染色观察脊髓结构变化,神经元存活状态,及胶质细胞演变情况;TUNEL检测神经元凋亡情况。结果1、术后1d三组大鼠BBB评分均为0分,3d后大鼠运动开始恢复,A组恢复较明显,但三组评分差异无统计学意义;7d、14d开始A组明显高于B组,B组高于C组(p<0.05)。2、术后MEP情况:术后1d三组大鼠右后肢MEP潜伏期均较术前延长,此后开始缓慢恢复。14d后A组潜伏期小于B组、C组,B组小于C组,差异具有统计学意义(p<0.05),波幅增加不明显。波幅自7d后开始恢复,两周后明显,A组大于B组、C组,B、C组无差异。3、脊髓含水量:术后1d,与正常值相比脊髓含水量明显增加(p<0.01),其中C组数值最大,在术后各个测量时间点脊髓含水量均明显高于A、B两组,A组最低;3d后脊髓水肿现象最为严重,含水量最高,C组与其余两组相比差异显著(p<0.01);术后7d脊髓水肿现象减弱明显,含水量显著下降,但依然显著高于正常值(p<0.05);术后14d,各组大鼠脊髓水肿现象明显好转或基本消失,含水量接近正常值。4、脊髓缺血面积:在术后1d,脊髓组织出现缺血现象,且C组现象最为明显;术后3d,随着脊髓水肿现象的加重,脊髓缺陷面积也达到最大;随后大鼠脊髓组织逐渐恢复,缺血面积也逐渐减小,在术后14d缺血面积显著减小,呈现出逐渐消除的趋势。5、HE染色:三组1d可见髓内弥漫性出血,细胞大量坏死;7d炎症细胞浸润,A组较轻;14d出血完全吸收,脊髓结构破坏,囊腔形成。NF-200染色:脊髓损伤1d后可见部分脊髓结构破坏,疏松、紊乱,局部组织出血,少量细胞水肿,三组NF-200+细胞比较,差别无统计学意义;3d可见出血少减轻,水肿明显加重,A、B组阳性细胞数多于C组(p<0.05);7d可见轴突间隙稍增大,空泡形成,A组阳性细胞多于其他两组,B组多于C组;14d轴突间隙进一步增大,空洞形成,脊髓破坏A组阳性细胞数多于B组,B组多于C组。GFAP染色:SCI后1d损伤处星形胶质细胞开始增多,少量炎症细胞浸润;7d时星形胶质细胞胞体增大,突触增多、延长,染色加深,A组GFAP+小于B组、C组;14d时胞核明显,胞体肥大染色深,突触相互连接,受损局部囊腔形成,细胞之间连接成网,三组GFAP+差异均有统计学意义,C组GFAP+明显多于其余两组。6、TUNEL检测:大鼠脊髓损伤后,各组IOD均呈上升趋势,在7d时IOD值达到峰值,14d时,IOD值明显降低。A组IOD值在各个测量时间点均明显低于其余两组,差别具有统计学意义(p<0.05),结果显示A组凋亡神经细胞数量较少,神经元恢复较快。结论1、硬脊膜切开及脊髓切开后可减轻脊髓损伤水肿程度,改善供血,利于肢体功能恢复,以硬脊膜切开后更为明显;2、硬脊膜切开更有利于损伤区神经元存活,减轻胶质细胞增生及瘢痕形成,减少细胞凋亡。第二章硬脊膜切开术治疗大鼠脊髓损伤时机的探讨目的观察大鼠脊髓损伤后硬脊膜切开不同时间恢复情况,探讨手术治疗最佳时机。方法健康成年清洁级SD大鼠60只,体重200-250g。实验动物购进后进行常规饲养,并观察健康状况及四肢活动有无异常,7天后开始实验。大鼠按照上文使用的改良Allen’s法制作重度脊髓损伤模型后,按随机数字表法随机分为A组(24h内硬脊膜切开),B组(72h硬脊膜切开组),C组(对照组,损伤脊髓不手术),每组各20只。采用BBB运动功能评分法观察1d、1w、2w、4w、6w后大鼠后肢功能恢复情况,各时间点大鼠后肢MEP波幅、潜伏期;TTC染色观察各组损伤区缺血面积;对损伤部位行H-E染色、NF-200、GFAP免疫组化染色观察脊髓结构变化,神经元存活状态,及胶质细胞演变情况。结果1、BBB评分,术后1d评分均为0分,术后1w、2w各组大鼠后肢功能较为明显恢复均大于C组(p<0.05);术后4w,A组评分明显高于B组和C组(p<0.05)。2、伤后1d三组潜伏期明显延长,1w后开始逐渐缩小,A、B两组明显较C组变小差异有统计学意义;2w以后A组较B组缩小更为明显,B组较C组缩小明显;1d后三组波幅均明显变小,差异无统计学意义;2w波幅开始明显增高,A、B两组均较C组增大,A组波幅大于B组,差异有统计学意义(p<0.05)。3、三组1d可见髓内弥漫性出血,细胞大量坏死;2w出血完全吸收,脊髓结构破坏,囊腔形成;6w纤维组织增生,瘢痕形成,C组较B组明显,B组较A组明显。4、大鼠脊髓损伤后手术后2w,6w,A组NF-200细胞数均多于B组、C组;A组的GFAP阳性细胞最少,C组最多。5、TTC染色情况:术后3组大鼠脊髓组织受损区域出现缺血现象;术后1w,各组脊髓缺陷面积差距最为明显,其中C组面积最大,A组缺血面积最小;在术后2w,脊髓状态好转,A组缺血面积比1w时显著减小,同时小于B组。4w后各组缺血面积与2w比较无明显变化。结论硬脊膜切开术24h组较72h组更明显改善供血,促进肢体功能恢复,72h后手术仍有意义;第三章硬脊膜切开术治疗大鼠脊髓损伤的机制探讨目的转录组测序筛选脊髓损伤段差异表达基因,探讨手术对脊髓损伤治疗机制。方法成年SD大鼠60只,体重200~250g,雌雄不限,按随机数字表法随机分为A组(硬脊膜切开组),B组(损伤脊髓不手术),C组(打开椎板不损伤脊髓)每组各20只,其中A组于脊髓损伤后24h时进行硬脊膜切开,B组在脊髓损伤后不进行硬脊膜切开手术。转录组测序分析差异基因情况;ELISA检测并对比各组8h、1d、3d、7d、14d的TNF-a、IL-1β、IL-6浓度;Western blot对比各组不同时间点AQP-4、NF-κB的表达;对比各组8h、1d、3d、7d各时间点自噬相关蛋白Beclin-l和LC3的表达及凋亡关键蛋白Caspase-3的表达。结果1、差异基因:A1与B1之间上调表达的约76,下调表达的497个;A2与B2之间上调表达的约182,下调表达的182个;A3与B3之间上调表达的约27,下调表达的62个。差异基因的功能涉及应激反应、离子通道、凋亡、信号传导、炎性反应、细胞代谢等诸多细胞生理过程。2、硬脊膜切开对脊髓损伤后炎症影响IL-1β因子:A、B两组在术后8h表达明显增加,3d达高峰,以B组最为明显;B组大于A组,A组大于C组(p<0.05)。在术后14d后,各组大鼠脊髓中IL-1β因子表达明显减少,A、B组相接近(p<0.05)。IL-6因子:术后8h后开始升高,3d达高峰,B组高于A组,A组高于C组(p<0.05)。在术后14d后明显下降,A、B两组差别无统计意义(p<0.05)。TNF-α因子:在术后8h表达明显增加,B组明显高于A组(p<0.05)。在术后3d达高峰,B组高于A组,A组高于C组(p<0.05)。此后表达明显下降。3、硬脊膜切开对脊髓损伤后水肿影响A、B组脊髓损伤后1dAQP-4蛋白表达开始增加,B组高于A组(P<0.05);3d时AQP-4蛋白表达高峰,A组表达量仍小于B组(p<0.05),此后各组表达量逐渐下降(图7)。NF-kB蛋白免疫印迹检测:A、B两组脊髓损伤后1d表达开始增加,以B组明显(p<0.05);3d时达高峰,A组表达量小于B组(p<0.05);此后表达量下降。4、硬脊膜切开对脊髓损伤后细胞自噬的影响Western blot结果提示正常对照组中LC3和Beclin-l的蛋白表达较少,脊髓损伤后8h开始增加,1d后明显增加,其中B组高于A组(p<0.05),在3d达高峰,其中A组低于B组(p<0.05),此后逐渐开始下降。5、硬脊膜切开对脊髓损伤后细胞凋亡的影响Western blot结果显示A组和B组脊髓组织Caspase-3的表达自脊髓损伤后8h即迅速上升,1d时B组高于A组(p<0.05);3d时表达达高峰,A组表达低于B组,A、B表达均高于C组(p<0.05);直到7d仍有较高表达。结论1、硬脊膜切开术可能通过降低AQP-4蛋白表达减轻脊髓水肿;2、硬脊膜切开能够减轻脊髓损伤区IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达,减少炎症反应;3、硬脊膜切开可能通过抑制炎症反应中转录因子NF-kB表达,减轻炎症反应过程。4、硬脊膜切开可减少自噬相关蛋白Beclinl和LC3的表达,减轻细胞自噬性损伤程度。5、硬脊膜切开可减轻脊髓损伤后凋亡相关基因Caspase-3的表达,减轻细胞凋亡。第四章椎板减压、硬脊膜切开、脊髓切开减压治疗脊髓损伤的临床观察目的观察椎板减压、硬脊膜切开、脊髓切开减压治疗脊髓损伤的效果,探讨手术适应、手术时机及治疗机制。方法以2013年1月至2016年9月本地区采用椎板减压、硬脊膜切开减压和脊髓切开减压治疗脊髓损伤患者23例,其中硬脊膜切开组10例、椎板减压组12例、脊髓切开1例;采用美国脊髓损伤协会(America Spinal InjuryAssociation,ASIA)脊髓损伤分级,评价手术疗效。结果术后MRI矢状面T2WI像脊髓水肿信号消失,脑脊液高信号连续性恢复;根据ASIA脊髓功能评价系统,2例A级患者术后1例提高为B级,1例仍为A级,但感觉平面下降3个阶段;桡侧腕伸长短肌、中指指屈深肌、小指外展肌恢复1级;13例B级患者6例恢复为C,6例恢复至D;8例C级患者6例恢复为D级,2例恢复为E级。1例髓内切开患者,术前为B级,术后恢复至C级。结论脊髓损伤后脊髓水肿,行椎板减压、硬脊膜切开和适当脊髓切开能够减轻脊髓继发性损伤,有助于脊髓神经功能的恢复。