鸡包涵体肝炎（IBH）是由禽腺病毒（AAV）引起雏鸡的一种急性传染病。该病自1963年由Helmbolelt和Frazier在美国的鸡群发现以来，已在世界许多国家流行，给养鸡业造成了重大的经济损失。我国于1985年首先在辽宁省发现该病，随后在其他省市自治区相继发现1BH的流行，1991年在内蒙古呼和浩特地区发生1BH。本研究课题应用采集的鸡包涵体肝炎自然病例的肝组织，通过SPF鸡胚传代和鸡胚肾原代细胞培养，分离到一株病毒Hb，该病毒株的复制可被5-溴尿嘧啶-2脱氧核苷抑制，对乙醚和氯仿有抵抗力，表明Hb株的核酸类型是DNA，且无脂质囊膜。Hb株对酸有抵抗力，对碱和热敏感。电镜观察表明，病毒粒子呈球形，直径为70-90nm。以上结果证明分离病毒Hb株为禽腺病毒，Hb株用标准毒株AAV-2，3，4，5，8型的分型血清进行中和试验表明为禽腺病毒8型。回归试验表明，Hb株能引起雏鸡出现鸡包涵体肝炎的病变群，其致病性较强。通过上述研究，成功地分离到一株鸡包涵体肝炎病毒，建立起了鸡包涵体肝炎病毒内蒙株FAV-Hb。应用FAV-Hb株试验感染SPF鸡胚，通过透射电镜对感染鸡胚肝脏的观察，表明FAV-Hb株可引起鸡胚肝细胞内形成三种类型的包涵体，即非病毒性中电子密度包涵体，病毒性包涵体和非病毒性高电子密度包涵体，各型包涵体均可见于胞核或胞浆内，但胞核是包涵体首先形成的部位，核内包涵体通过核膜进入胞浆。各型包涵体在其形成过程中有较密切的关系。应用限制酶HindⅢ和Ecorl双切鸡包涵体肝炎病毒Hb株的六邻体蛋白基因片段重组质粒，得到大小559bp的基因片段，经地高辛标记制备DNA探针，其灵敏度为0.1-0.3ng／ul。用该探针对感染鸡包涵体肝炎病毒的雏鸡肝组织进行原位杂交，结果表明病毒经口感染后12小时肝细胞内出现病毒的复制，3-7天时病毒复制明显，9-16天病毒复制减弱。原位杂交表明鸡包涵体肝炎病毒主要定位于核内，同时也可进入胞浆中。为了研究肿瘤坏死因子在鸡包涵体肝炎发病机理中的作用，本研究用卡介苗（BCG）和大肠杆菌内毒素（LPS）经静脉注射健康鸡诱生TNFα，用微量细胞病变法经L₉₂₉细胞检测外周血清、外周血白细胞和脾脏TNFα的活性，表明外周血清TNFα活性最高，脾脏TNFα活性次之，外周血白细胞TNFα活性最弱。应用LPS诱生的鸡培养白细胞提取RNA，参考几种动物的TNFα保守序列设计一对引物，以提取的培养白细胞RNA为模板，应用RT-PCR扩增目的基因片段，将PCR产物与PUC₁₉连接，转化到大肠杆菌DH₅₂进行分子克隆，对提取的重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定，表明成功克隆出一段TNFα基因片段，其长度与预计相符为576bp。对鸡肿瘤坏死因子的诱生、活性测定、基因片段的分子克隆及序列测定，为 TNF a在鸡疾病中作用研究，以及 TNP o的全序列分析，基因表达，核酸探针制备提供了条件。以上述研究为基础，本课题对鸡包涵体肝炎 TNF o的动态变化、TNP o的 mRNA表达水平及细胞凋亡做了较详细的研究。结果表明，FAV－Hb感染后第 3天在外周血开始测出 TNF Q活性，以后逐渐上升，第4天达到小的峰值，随后下降，第13天基本消失，并持续到第16天，从 21天 TNF a活性又开始回生，第 46天时达到最高峰，以后缓慢下降。在感染鸡脾脏 TNF a活性的变化规律与外周血基本一致。应用地高辛标记 TNF o基因片段，制备核酸探针，通过核酸原位杂交成功地检测了鸡包涵体肝炎病毒感染鸡的组织细胞 TNF Q的 InRNA表达水平。研究结果表明，Hb株感染雏鸡后，在肝脏、脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体中能检测到一定数量的 TNF a的 mRNA信号，其中在5下天和3666天时阳性细胞数量较多，其它感染时间阳性细胞少，阳性信号弱，甚至检测不到阳性信号。病理组织学观察证实，FAV十b感染后，从第1天到第56天，感染雏鸡肝脏的枯氏细胞、脾脏、胸腺、法氏囊和盲肠扁桃体的网状细胞表现出不同程度的活化增生，其增生程度与外周血及脾脏 TNF Q活性和 TNFa的 IuRN表达水平基本一致。应用原位末端标记方法，对试验感染 F＾V－Hb的雏鸡肝脏和胸腺细胞的凋亡检测，表明鸡包涵体肝炎可出现肝细胞和胸腺细胞的凋亡过程，且多数凋亡细胞核结构完整，处于早期凋亡阶段，少部分凋亡细胞核破碎或核浓缩。本研究揭示了 FAV－Hb感染可诱导鸡 TNF Q的表达和分泌水平升高，并引起细胞凋亡，TNF a在鸡包涵体肝炎的发病机理中具有重要作用。