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研究背景流感病毒可跨物种传播感染,严重危害人类健康和公共卫生。近年来,全球范围内报告的季节性流感活动主要以A型、B型流感病毒为主。A型流感病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不断重组、重配是导致病毒感染不可控的主要因素。由于近年来H3N2为代表的A型流感病毒不断发生变异,导致疫苗“脱靶”,同时诱导病毒株出现耐药,这对A型流感的预防及治疗提出更大的挑战。为更好地研究A型流感病毒的致病机制及评估药物有效性,建立合适的动物模型至关重要。目前,国外已建立H3N2流感病毒适应株或利用反向遗传学技术构建H3N2病毒株并建立了相关动物模型。然而,国内尚缺乏相关资源。本研究建立了 H3N2鼠肺适应株及其感染小鼠模型,为筛选新型疫苗株、研发及评价相应的治疗药物等提供了工作基础。研究目的建立季节性流感病毒H3N2鼠肺适应株及其动物模型,并初步探讨其适应株致病力变化的相关机制。研究方法1.建立季节性流感病毒H3N2鼠肺适应株1)将季节性流感病毒H3N2野生株（A/Aichi/2/68（H3N2）（WT））经鼻感染BALB/c小鼠,在病毒复制高峰期收集肺组织,将制备的匀浆上清连续滴鼻感染小鼠进行传代;2)在传代适应过程中,比较不同代次病毒感染后小鼠出现的临床症状,病毒在肺组织中的分布、复制情况及病理损伤;3)对H3N2适应株病毒的全基因组进行测序,并用MEGA对比分析不同代次毒株的全病毒序列差异;4)利用CBA技术分析比较不同代次病毒感染小鼠的血清及肺泡灌洗液中炎性细胞因子的表达水平变化;5)利用TSA多重免疫荧光标记技术分析比较不同代次病毒感染小鼠后肺组织局部聚集的免疫细胞类型变化。2.建立H3N2鼠肺适应株小鼠模型将H3N2流感病毒鼠肺适应株（MA-7）以2LD50滴鼻感染BALB/c小鼠,观察小鼠感染后的临床症状,检测病毒在各组织中的分布及复制情况,检测肺组织病理学变化,评价模型构建成功。研究结果季节性流感病毒（A/Aichi/2/68（H3N2）（WT））经过在小鼠体内进行7次传代后,获得了鼠肺适应株。该适应株在小鼠体内致病力显著增强,具体表现为以下几个方面:1.野生株感染小鼠后并未观察到流感样症状,鼠肺适应株尤其是第7代病毒适应株（MA-7）感染后,小鼠出现弓背、竖毛,体重持续下降且在感染后14天内全部死亡;2.鼠适应株感染小鼠后肺组织表现为明显的病毒性间质肺炎;3.鼠肺适应株（MA-7）在HA、NA、PA和NP上共发现有5个突变位点（HA（P162Q、N483D）、NA（V398）、NP（D290N）、PA（G631S））与致病力增强密切相关;4.鼠肺适应株尤其是第7代病毒适应株（MA-7）感染后,小鼠的血清及肺泡灌洗液内细胞因子（IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-y、IL-5）、趋化因子（MCP-1）及集落刺激因子（GM-CSF）表达急剧升高,形成细胞因子风暴;5.鼠肺适应株尤其是第7代病毒适应株（MA-7）感染,导致小鼠肺组织局部免疫细胞浸润,其中适应性免疫细胞（CD4+T、CD8+T、Treg）及固有免疫细胞（NK、DCs）比例显著升高,同时H3N2病毒感染细胞周围（100μm内）募集到大量的CD4+T、CD8+T、自然杀伤细胞。在H3N2病毒鼠肺适应株动物模型建立过程中,WT型病毒（对照组）感染小鼠无明显症状且未检测到病毒复制。鼠肺适应株（MA-7）感染小鼠在9天内全部死亡,体重下降率接近30%,多组织内均能检测到病毒复制,其中肺组织中病毒滴度高达105.5TCID50并出现肺泡间隔增宽、炎细胞浸润等病毒性间质肺炎病理变化。根据小鼠感染后的症状观察结果、病毒复制情况、肺组织病理改变等指标,评定H3N2鼠肺适应株小鼠模型构建成功。结论1.获得季节性流感病毒H3N2鼠肺适应株;2.建立H3N2鼠肺适应株动物模型;3.5个突变位点与H3N2鼠肺适应株致病性增强密切相关;4.鼠肺适应株（MA-7）感染可诱发机体发生强烈的免疫反应,如细胞因子风暴、大量炎性细胞浸润等。