目的:本研究通过建立小鼠不育模型,检测Piwil2蛋白及Stat3、Bcl-2蛋白在雄性不育小鼠睾丸组织中的表达状况,及探讨三者表达之间存在的潜在位置及量的相关性;并进一步阐明Piwil2蛋白在不育发生发展中的作用及相关机制。方法:取雄性昆明种小鼠60只,随机分为实验组与对照组,每组30只。实验组小鼠采用雷公藤多苷药物造小鼠不育模型。每天对小鼠进行雷公藤多苷混悬液灌胃,剂量按照小鼠体重以0.001 ml/g进行,每天一次,持续28 d。对照组小鼠使用生理盐水进行灌胃,剂量、及持续时间与实验组一致。造模后将两组雄性小鼠分别与雌性小鼠交配,观察雌性小鼠的受孕状况;一周后再将雄性小鼠处死,分别取出两组小鼠的双侧睾丸组织及附睾。对两组小鼠的附睾分别进行精子计数;分别采用免疫组织化学染色法和蛋白印迹检测法来以分别检测两侧睾丸组织样本中Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白的表达状况,并采用定量PCR方法检测三种蛋白在睾丸组织中的mRNA的表达水平。将实验组与对照组的检测结果进行比较,观察两组的蛋白表达的差异性及三种蛋白表达的相关性。结果:1.H.E染色结果显示,对照组小鼠睾丸组织结构发育正常,生精上皮厚薄均匀,精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及睾丸间质细胞增殖及发育正常(图3.1a);相对于对照组小鼠,实验组小鼠睾丸组织结构明显破坏,生精上皮明显变薄且不均匀。生精小管分布相对于对照组稀疏,精原细胞、初级和次级精母细胞及睾丸间质细胞增殖减少,发育异常,精子细胞明显缺失(图3.1b)。结合与雌鼠交配后,雌性小鼠受孕率明显下降的结果,及实验组小鼠附睾计数明显减少,说明小鼠不育模型造模成功。2.免疫组化(IHC)染色结果显示,Piwil2蛋白在精原细胞初级精母细胞、次级精母细胞细胞质中有表达,在睾丸间质细胞中也有一定量的表达;Bcl-2蛋白分布于精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞以及精子细胞细胞质及细胞核中;Stat3蛋白则分布于睾丸间质细胞细胞质内(图3.2)。染色评分结果显示:相较于对照组,实验组Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白的染色程度明显降低及阳性细胞数均明显减少(P<0.01);IHC染色评分结果显示,在对照组中Piwil2蛋白在各个生精小管中(包括精原细胞、初级精母细胞及次级精母细胞)及少量间质细胞内均有稳定的高表达,实验组则是低表达状态,且实验组相较于对照组Piwil2蛋白在精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞及间质细胞中的表达量明显降低(P<0.001)(表3.2)。同样对照组的Bcl-2及Stat3蛋白均为稳定高表达,相较于对照组,实验组表达量显著降低(P<0.001)(表3.2)。3.Western Blot结果显示,实验组的蛋白表达量较于对照组,Piwil2蛋白减少幅度超过60%,Stat3及Bcl-2蛋白减少幅度均超过90%,两组间的蛋白表达量均有明显差异(Piwil2蛋白P<0.05,Stat3蛋白P<0.05,Bcl-2蛋白P<0.01)。4.定量PCR结果显示,实验组的三种蛋白mRNA相对表达量比对照组的相对表达量明显下降,Bcl-2蛋白的mRNA下降更为明显,且两组间三种蛋白的mRNA相对表达量差异具有统计学意义(Piwil2蛋白P<0.01,Stat3蛋白P<0.001,Bcl-2蛋白P<0.05)结论:本研究观察显示Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白在雄性不育小鼠睾丸组织的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞及间质细胞中表达量均显著降低,且三种蛋白在生精小管中(包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞)及间质细胞内的表达位置存在相关性。通过本实验对Piwil2、Stat3及Bcl-2蛋白的表达量及位置的检测,阐释了三种蛋白可共同调控小鼠精子生成,三者的缺失对小鼠不育的发生至关重要。且三个蛋白相互作用间存在着潜在的相关性。