秋茄(Kandelia candel(L.)Druce)是一种非泌盐红树植物,主要分布在热带、亚热带海滨潮间带地区,是维护海岸生态平衡的重要绿色植被,同时也是研究木本植物耐盐分子生理机制的良好材料。本研究从mRNA和蛋白质水平上对秋茄响应盐胁迫的分子调控网络进行了研究,并通过生理生化指标测定和叶绿体超显微结构观察对转录组测序和蛋白组鉴定结果进行了验证。本文首次系统地研究了木本红树植物秋茄响应盐胁迫的分子生理机制和调控网络,同时发现了若干有别于草本植物的耐盐生理特征。1.秋茄响应盐胁迫的叶绿体蛋白质组研究叶绿体是绿色植物进行光合作用的主要场所,也是对盐胁迫最敏感的细胞器。本文应用iTRAQ定量蛋白质组学技术在亚细胞水平上系统研究了不同浓度NaCl胁迫下秋茄光合作用的光反应和碳反应蛋白质组的动态变化特征。结果显示76个表达量变化在1.5倍以上的蛋白质,包括:光反应(52%),碳反应(29%),ATP合成(2%),氨基酸转运(2%),蛋白合成(2%),抗氧化相关蛋白(7%)和其他蛋白(5%)。在200-600 mM NaCl胁迫下,随着盐浓度的增加,光反应相关蛋白呈现上调表达趋势,而在200-400 mM NaCl胁迫下大部分碳反应相关蛋白表达量不变,但在高盐(600nM NaCl)胁迫下表达量下调。本研究发现,盐胁迫下秋茄光合作用能够正常进行与光反应相关蛋白的上调表达以及大部分碳反应相关蛋白表达量的稳定密切相关;而高盐胁迫下秋茄光合速率下降主要是由于卡尔文循环中羧化和还原两个阶段相关酶下调表达引起的,即非气孔因素。2.秋茄响应盐胁迫的叶片光合速率(Pn)、荧光参数及叶绿体超显微结构研究通过对不同浓度NaCl胁迫下秋茄Pn测定和叶绿体超显微结构观察,分析了叶片Pn、PS Ⅱ最大光化学效率(Fv/Fm)及光合机构损伤情况。研究发现,在200-600 mM NaCl胁迫下秋茄叶片Fv/Fm没有发生显著变化,说明秋茄能够维持正常的PSⅡ光化学活性及光合电子的传递。然而,高盐胁迫下红树植物秋茄的Pn显著下降,且Pn与胞间CO2浓度(Ci)的变化成相反趋势,结果验证了叶绿体蛋白组的研究发现,即高盐胁迫下引起光合作用下降的原因是非气孔因素;叶绿体超显微结构的电镜观察显示,高盐胁迫下秋茄类囊体膜结构轻微膨大,但基粒类囊体结构没有受到破坏。另外,研究还发现叶绿体中嗜锇颗粒增多,嗜锇颗粒可以作为脂质库提供给类囊体膜防止膜质过氧化的发生、维持细胞渗透势及细胞正常吸水。3.秋茄响应盐胁迫的叶片转录组和蛋白质组研究应用RNA-seq和iTRAQ技术对不同浓度NaCl胁迫下秋茄叶片转录组和蛋白质组进行研究,从mRNA和蛋白质水平上全面揭示秋茄响应盐胁迫的分子机制。同时采用qRT-PCR和RT-PCR以及Western blot技术分别对差异基因和蛋白进行验证分析。RNA-seq技术共鉴定到6,285个差异表达基因。iTRAQ定量蛋白质组技术共鉴定到3,676个蛋白,其中有263个蛋白表达量变化在1.5倍以上且Unique Peptide≥2。研究发现参与苯丙烷代谢、氨基酸代谢、DNA复制和修复以及IP3-Ca2+信号转导通路相关的基因显著上调。然而,这些基因编码的蛋白却大多数变化不显著或少数上调表达,说明短期内(3天)秋茄叶片对盐胁迫的响应主要是转录水平调控,这也是盐胁迫下秋茄叶片mRNA和蛋白表达的关联性较差的主要原因。RT-PCR和qRT-PCR对相关差异基因进行验证的结果与转录组数据一致。4.秋茄响应盐胁迫的IP3-Ca2+信号通路介导GABA积累的研究植物体内IP3-Ca2+信号通路可以介导谷氨酸(Glu)合成γ-氨基丁酸(GABA)和脯氨酸(Pro),而GABA和Pro的积累是植物响应逆境胁迫的一种重要生理机制。在逆境下大多数植物积累Pro。然而,本研究发现Pro合成相关的关键基因吡咯啉-5’-羟酸氧化酶(P5CS)表达水平没有发生显著变化,游离Pro含量也没有显著变化;值得注意的是,我们发现盐胁迫下秋茄IP3-Ca2+信号通路介导GABA积累的磷脂酶C(PLC)和钙调蛋白(CaM)以及谷氨酸脱羧酶(GAD)三个关键基因显著上调,GAD活性也显著增加,同时GAD催化合成的GABA的含量也增加。这一结果表明,IP3-Ca2+信号通路介导了 GABA合成,说明盐胁迫下秋茄是通过积累GABA作为渗透调节和抗氧化物质,而不是Pro。该发现提示GAD催化Glu合成GABA的积累是木本红树植物秋茄耐盐性的重要生理特征之一。5.秋茄响应盐胁迫的叶片生理生化指标研究对不同浓度NaCl胁迫下的秋茄叶片离子含量、活性氧的产生、可溶性糖和淀粉含量、抗氧化相关酶活性、GSH含量、游离氨基酸含量和苯丙烷代谢途径相关酶活性及产物含量进行分析。研究表明,秋茄能够很好的调节Na+、K+等离子的平衡,减少离子的毒害作用。盐胁迫诱导秋茄体内ROS产生,主要是H202。秋茄抗氧化酶活性的增强及GSH含量的增加有利于ROS的清除,提高耐盐性。盐胁迫下秋茄体内可溶性糖积极参与了细胞的渗透调节,而在高盐胁迫下甘露醇可能在渗透调节中起重要作用。盐胁迫下秋茄叶片Glu、天门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)含量增加,Glu含量占了总游离氨基酸含量的50%以上,Thr和组氨酸(His)随着盐胁迫浓度的增加变化倍数最显著(5和34倍),游离氨基酸的积累在抗氧化和渗透调节方面起重要作用。盐胁迫下秋茄苯丙烷代谢加强,有利于相关次生代谢产物的合成。研究表明,盐胁迫下秋茄花青素、类黄酮和木质素等次生物质的积累在提高秋茄耐盐性中发挥重要作用。这些结果在生理生化水平上验证了转录组和蛋白质组研究获得的结论。本研究成果为木本植物耐盐分子生理机制提供了新的理论依据,具有重要的学术价值;同时对沿海滩涂湿地生态系统修复、开发利用以及培育抗盐性林木和作物都具有重要意义。