本研究基于临床中出现的现象——HCC病人肝癌组织切片中出现PPARγSer84位的磷酸化高表达，这种现象虽然未经大量临床标本分析所证实，但却提示我们:PPARγSer84可能与HCC的发展具有内在联系，因此，本论文从研究PPARγ磷酸化在HCC病程发展中的确切作用出发，首次探讨了两者之间的联系及可能的分子机制。　　本论文研究工作包括以下四方面:　　一、PPARγ磷酸化与HCC发展的关系　　1. HCC自发模型构建及PPARγ磷酸化分析:使用化学诱变剂二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)诱导小鼠HCC自发模型，测量并观察在12个月实验期间，小鼠的体重，生长以及死亡情况;通过病理切片分析与HCC相关标志物（Ki67、PCNA和AFP）分析，证实小鼠HCC模型诱导成功;免疫组化、western blot结果分析显示，与正常肝组织相比，HCC小鼠肝脏中磷酸化PPARγ(Ser82)的表达水平显著升高;EMSA结果表明，小鼠肝癌组织中PPARγ的转录活性明显下降;值得注意的是:随着HCC发展进程的变化，PPARγ磷酸化的表达水平逐渐升高，提示PPARγ磷酸化与小鼠HCC的恶性进展具有内在联系。　　2. 裸鼠模型构建与体内实验:首先运用ViraPowerTM Lentiviral ExpressionSystems包装过表达野生型(wild type，WT)、非磷酸化(S84A)和磷酸化(S84D)PPARγ的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞，Blasticidin药物进行细胞抗性筛选，得到PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D稳转HepG2细胞株;接着将三种稳转的HepG2细胞接种于裸鼠皮下，构建HCC异位模型。测量实验期间，小鼠的体重、肿瘤体积、生长以及死亡情况。结果显示:PPARγS84D中肿瘤的生长速度最快、瘤体最重，这组肿瘤中PCNA的表达水平最高;与PPARγWT相比，PPARγS84A肿瘤生长速度慢、瘤体重量轻、PCNA表达水平低，但瘤体重量的差异没有统计学意义。说明PPARγ磷酸化介导肝癌细胞增殖、生长，引起肿瘤生长加快，并促进肿瘤恶性进展。　　3. 人病理标本中PPARγ酸化分析:收集临床17例肝癌病人HCC样本，进行病理切片及肿瘤标志物检测;运用免疫组化检测结果显示，12例病人中出现了HCC区域PPARγ磷酸化表达水平高于癌旁肝组织，70％的比例提示PPARγ磷酸化对人HCC的发展可能有促进作用。因为未能收集足够正交试验的病理标本数，所以此项实验结果仅起参考作用。　　二、MEK/ERK激酶介导的POARγ磷酸化及其对HCC发展的影响　　1. MEK/ERK激酶活性分析:在DEN诱导的HCC动物模型中，运用免疫组化、western blot对MEK/ERK激酶水平进行分析。结果发现:与PPARγ磷酸化程度相平行，PPARγ磷酸化上游激酶ERK1/2的表达水平增加，同时对ERK1/2的上游激酶MEK的分析显示磷酸化MEK表达水平上升，ERK1/2与MEK磷酸化水平皆显著高于正常C57小鼠的肝组织;运用免疫组化分析肝癌病人HCC样本，亦发现在癌组织中，磷酸化ERK1/2和磷酸化MEK的表达量显著高于癌旁组织。这些结果提示:在HCC发展中，PPARγ磷酸化程度增加可能是由于MEK/ERK激活所致。　　2. 抑制MEK/ERK激酶活性可降低PPARγ磷酸化水平:为进一步证实MEK/ERK激活导致PPARγ磷酸化，我们运用SMMC7721、Hep3B、HepG2和Hepa1-6建立了体外分析的细胞模型，运用MEK激酶抑制剂PD0325901处理肝癌细胞，以观察是否可通过抑制激酶的活性，而改变PPARγ磷酸化的表达水平。Western blot分析发现当MEK/ERK被抑制后，PPARγ磷酸化水平降低，荧光素酶报告基因结果亦显示:PPARγ磷酸化水平被抑制同时，PPARγ转录活性提高，说明通过抑制MEK/ERK，可以降低PPARγ磷酸化进而提高PPARγ的转录活性。与此同时，运用MTT和流式分析肝癌细胞增殖与细胞周期状态，发现PPARγ磷酸化水平降低后，肝癌细胞增殖速度被抑制，细胞周期阻滞在G1期，值得注意的是，动态分析结果显示在0，24，48 hr时间段内，HCC细胞增殖力与PPARγ磷酸化程度呈正相关。　　3. MEK/ERK对PPARγ磷酸化作用的体内分析:在细胞实验基础之上，我们进一步运用动物实验进行MEK/ERK对PPARγ磷酸化效应分析，实验首先构建HepG2裸鼠种植瘤模型，等肿瘤体积达到100 mm3时，将小鼠随机分为DMSO、罗格列酮(rosiglitazone，RSG)、PD0325901、RSG+PD0325901四组，腹腔注射给药28天，分析抑制MEK/ERK是否可抑制PPARγ磷酸化，观察RSG是否协同PD0325901，增效其抑制HCC恶性进展的功能。结果显示:抑制MEK/ERK后，PPARγ磷酸化程度显示降低，肿瘤生长速度明显减缓，肿瘤体积减小，RSG对PPAR磷酸化表达水平的抑制程度较小、对肿瘤生长速度和肿瘤体积没有影响，RSG和PD0325901联合用药与单独使用PD0325901的效果接近。　　三、PPARγ磷酸化对肝癌细胞生长的影响　　1. PPARγ磷酸化增强肝癌细胞增殖:对表达PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D稳转HepG2细胞株进行NimbleGen全基因组表达谱芯片实验分析，GO分析报告显示，调节细胞增殖能力的基因差异表达显著富集，进一步运用Q-PCR验证芯片分析结果发现:与PPARγWT、PPARγS84A相比，PPARγS84D细胞中促增殖基因表达显著升高;进一步运用MTT实验、细胞克隆形成实验以及CFSE流式检测结果亦证实:PPARγS84D细胞增殖能力显著高于PPARγWT与PPARγS84A细胞，说明肝癌细胞中PPARγ磷酸化后改变了下游转录模式，使肿瘤细胞增殖力显著增强。　　2. PPAR磷酸化抑制肝癌细胞细胞周期阻滞:进一步通过流式分析检测HepG2稳转细胞株的细胞周期变化，结果显示:PPARγS84DHepG2细胞中，处于G1期的细胞数目减少，而S期细胞数目增加，说明PPARγ磷酸化抑制细胞周期阻滞;Q-PCR对周期调控分子的检测实验表明:PPARγ磷酸化降低了控制G1期的蛋白依赖性激酶抑制子（p18、p21和p27）的表达水平，促进cyclin A的表达，说明PPARγ磷酸化后，可通过调控细胞周期调控分子对细胞周期进行干扰，使细胞周期阻滞减弱。　　3. PPARγ磷酸化对肝癌细胞细胞凋亡不产生影响:以上细胞实验充分证明:PPARγ磷酸化可通过增强肝癌细胞增殖与抑制肝癌细胞细胞周期阻滞，而促进肝癌细胞生长。运用AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡，结果显示:在PPARγWT、PPARγS84A和PPARγS84D稳转的HepG2细胞中，细胞凋亡没有显著差异。　　四、肝癌细胞糖酵解重要功能基因分析　　1. 芯片分析:在验证了MEK/ERK激酶介导的PPARγ磷酸化对HCC发展产生确切影响的基础之上，运用生物信息学分析法对PPARγW、PPARγS84A和PPARγS84D稳转细胞株进行全基因组表达谱进行分析，根据评分及生物信息学方法对芯片数据进行分析，发现PPARγ磷酸化显著影响细胞糖酵解途径中的重要的功能酶。与PPARγS84A相比，PDK-1、PGK1、PFK2等酶在PPARγS84D细胞中发生了上调;进一步对差异基因进行Q-PCR进验证，结果与芯片分析数据相符，验证了芯片数据所指示糖酵解途径差异表达，说明PPARγ磷酸化对肝癌细胞的糖酵解产生了影响。　　2. 葡萄糖和乳酸检测:根据芯片数据，我们运用葡萄糖、乳酸分析法在HepG2及三种PPARγHepG2稳转株中进行了细胞分解葡萄糖能力的分析，结果显示:与PPARγS84D细胞株相比，PPARγWT和PPARγS84A都对葡萄糖摄入量显著减少，用MEK抑制剂PD0325901处理HepG2后，细胞表现出极显著的葡萄糖吸收和乳酸释放量。说明PPARγ磷酸化可伴随细胞糖酵解增强，这也解释了肝癌细胞快速生长的原因。　　综上所述，本论文研究工作首次建立了PPARγ磷酸化与HCC发展之间的联系，即PPARγ磷酸化对HCC发展具有促进作用。基于该生物学效应的发现，我们进行了进一步的细胞与动物实验研究工作，发现MEK/ERK激酶为介导PPARγ磷酸化的关键激酶，抑制MEK/ERK激酶可加强肝癌细胞的细胞周期阻滞、抑制细胞增殖，从而表现出对HCC发展的良好遏制作用，提示与PPARγ磷酸化修饰相关的分子节点在介导HCC发展中的重要性。研究还发现PPARγ磷酸化后，其下游转录模式发生了变化，导致差异表达基因富集于糖酵解途径，糖酵解水平增高使肝癌细胞保持快速生长，促进HCC向恶性化程度发展。