鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种上皮源性恶性肿瘤,绝大多数属于低分化鳞状细胞癌,恶性程度高,早期易发生淋巴结和全身远处转移,具有相当高的死亡率。鼻咽癌的地区分布极不均衡,在我国南方及东南亚一带发病率较高,其中又以广东省的发病率最高,故有“广东瘤”之称。目前认为遗传因素、EBV(Epstein-Barr Virus)感染、遗传易感性、饮食和某些环境化学促癌物和／或致癌物因素与鼻咽癌的发生发展密切相关,在这些因素的共同作用下,正常鼻咽上皮细胞发生遗传和表观遗传学改变不断积累,最终引起细胞的恶性转化,导致鼻咽癌的发生。但NPC的发病机制尚不清楚。肿瘤的发生发展是一个多因素参与、多基因改变、多步骤演进的复杂过程,受到体内、外各种因素的作用和影响,是许多肿瘤瘤基因激活或肿瘤抑制基因失活所致。瘤基因是由于存在正常细胞中的原瘤基因在某些致瘤因素作用下激活而成,瘤基因的活化是人类肿瘤发生发展的重要因素,瘤基因数量的增加或表达活性的增加或突变,均会导致肿瘤的发生。抑瘤基因是作用细胞增殖和分化的重要调控因子,在正常细胞中起阻滞细胞增殖,促进细胞分化的功能。抑瘤基因的缺失或突变失活可使瘤基因充分发挥作用也会导致恶性肿瘤的发生发展。在鼻咽癌的发生发展,瘤基因和抑瘤基因同样起关键作用。迄今为止,鼻咽癌抑瘤基因的研究,已有重大进展,RASSF1A、BLU、BRD7、DAPK1、DLC1等多个基因已在基因表达变化沉默后对细胞生物学行为的影响等方面被证实具有鼻咽癌抑瘤基因的潜质,而且发现其分子机制主要为基因的甲基化。但鼻咽癌瘤基因的研究则相对滞后,虽然已有BCL2、CCND1、EGFR、TP73L、EVI1、HRAS、NRAS、STAT2、INT2、FGF3、MDM2、MYC、PIK3CA等基因由于在鼻咽癌中的扩增或过表达而被推测为鼻咽癌潜在的瘤基因,但鲜有报道过表达后对细胞生物学行为的影响,更没有体内报道。因此,探索鼻咽癌瘤基因及其作用机制对于揭示鼻咽癌的发病机理就显得尤为重要。本实验组前期通过收集五个实验室发表的170例鼻咽癌比较基因组杂交(CGH)数据构建鼻咽癌发病机制的树模型。研究结果提示了11个鼻咽癌的重要染色体变异事件,其中12p12-11区域的扩增是鼻咽癌发生发展的早期事件,但是该区域仍然含有上百个基因。2005年Garraway等人结合SNP芯片和表达谱芯片分析发现黑色素瘤瘤基因MITF。我们先前采用同样的办法,整合分析本实验室已有的五种鼻咽癌细胞(CNE1,CNE2,HONE1,5-8F 6-10B)和NP69的SNP芯片数据和三种鼻咽癌细胞(CNE1,CNE2, HONE1)和NP69的表达芯片数据,结果发现了12p12-11区域既扩增又过表达基因PTHLH。PTHLH是甲状旁腺激素受体家族成员,在恶性肿瘤的体液性高钙血症、乳腺癌和前列腺癌的骨转移中发挥作用,能促进结肠癌细胞的增殖、浸润、迁移及成瘤能力。因此,我们推测PTHLH基因可能在鼻咽癌发生发展中起重要作用。基于前面工作的基础上,本课题的研究目的为采用整合分析方法,筛选鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、HONE1基因组中的可能相关的瘤基因及抑瘤基因,对其进行初步的生物信息学研究。接着改变作为候选靶基因之一PTHLH的表达水平,观察其对鼻咽癌细胞株生物学行为的影响及可能的作用机制,为深入理解鼻咽癌发病的分子机制和寻找新的分子靶向治疗靶点奠定理论基础,为此本课题进行了如下研究：(一)瘤基因及抑瘤基因筛选及初步生物信息学分析通过Ensembl database整合鼻咽癌细胞株SNP芯片数据、表达谱数据及已知正常拷贝数变化CNVs数据,筛选鼻咽癌细胞中可能相关的瘤基因及抑瘤基因。得到160个可能相关的靶基因,其中既扩增又过表达为102个,既缺失又低表达为58个。从160个基因当中随机抽取9个基因进行表达水平的检验,结果示除ILK外都与芯片结果一致,因此芯片结果可靠。PANTHER软件分析显示这160基因的功能包括：转录因子,核酸及脱氧核酸结合因子,膜运输蛋白及调节蛋白,各种生物酶和激酶等,参与的通路主要包括P53通路、细胞周期、凋亡通路等。由于这些生物学功能涉及到了肿瘤发生发展及侵袭转移的多个阶段,因而瘤基因／抑瘤基因在鼻咽癌中的表达失调,可能通过调控下游一系列靶基因的表达进而引起鼻咽癌细胞多方面生物学特性的改变。随后我们利用GenCLiP软件分别对三组基因(102可能相关的瘤基因、58可能相关的抑瘤基因和160二者混合基因)进行聚类分析和构建基因网络。结果三组基因都与瘤／抑瘤基因、EMT、鼻咽癌、EBV存在着密切关系。我们对其中与“瘤／抑瘤基因”的相关性进行10,000次的随机模拟,结果三组基因的P值分别为0.008、0.044和0.006,证明我们筛选的基因确实为鼻咽癌的可能相关的瘤／抑瘤基因。GenCLiP还预测PTHLH可能通过CDK2影响鼻咽癌的异常生长。(二)过表达PTHLH对鼻咽癌的影响我们前期已证明PTHLH是鼻咽癌细胞株染色体12p12-11中唯一既扩增又过表达的候选靶基因。因此,本研究在鼻咽癌细胞株中过表达PTHLH,观察其对鼻咽癌细胞株生物学行为的影响,并预测可能与其共同作用的候选靶基因。采用荧光定量RT-PCR检测5-8F、6-10B、CNE1、CNE2和HONE1等5种鼻咽癌细胞株和永生化鼻咽上皮细胞株NP69中PTHLH的表达情况,结果显示6种细胞株中PTHLH的表达差异具有显著性(F=100.473,P=0.000)。运用2-ΔΔCt法对6种鼻咽癌细胞株中PTHLH的表达水平与NP69相比较,结果发现PTHLH在5-8F、CNE1、CNE2和HONE1中的表达水平均高于NP69,而在CNE1中的表达水平最低。因此选CNE1作为过表达细胞珠。通过克隆重组PTHLH,构建慢病毒表达载体pGC-FU/PTHLH,病毒包装后感染CNE1细胞,然后六孔板分选鉴定GFP+细胞,建立了稳定过表达PTHLH的鼻咽癌细胞株CNE1pGC-FU/PTHLH.采用MTT法检测PTHLH过表达后细胞的体外增殖情况,结果显示与CNE1pGC-FU和CNE1细胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH细胞的增殖速度显著增快,并且呈时间依赖关系(F=1208.48,P=0.000)。平板克隆形成实验的结果同样显示四组细胞的增殖能力具有显著性差异(F=43.771,P=0.000)。流式细胞仪检测四组细胞的细胞周期分布,结果显示与CNE1pGC-FU和CNE1细胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH细胞周期G1期、S期存在显著性差异(F=12.722,P=0.002)(F=42.888,P=0.000)。综上所述,PTHLH的过表达显著促进了鼻咽癌细胞的体外增殖能力。采用Transwell小室检测PTHLH过表达后细胞体外迁移运动能力的改变,结果显示与CNE1pGC-FU和CNE1细胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH细胞穿过聚碳酸酯膜的细胞数增多,差异具有显著性(F316.382,P=0.000)。划痕实验亦出现如上所诉结果。结果表明PTHLH过表达后显著增强了鼻咽癌细胞的体外迁移。对预测的可能与PTHLH存在于同一信号通路的基因CDK2,利用荧光定量PCR进行验证。结果显示与CNE1pGC-FU和CNE1细胞相比,CNE1pGC-FU/PTHLH细胞CDK2的表达差异具有统计学意义(F=5.527,P=0.024)。表明过表达PTHLH影响CDK2的表达水平。在鼻咽癌中,二者通过何机制、通路发挥作用,善进一步研究。结论1)通过整合分析鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2和HONE1以及永生化鼻咽上皮细胞株NP69的SNP芯片和表达谱芯片数据,筛选出160个可能相关的瘤基因及抑瘤基因,其中既扩增又过表达的瘤基因102个,既丢失又低表达的抑瘤基因58个。2)这160个可能相关的靶基因与EBV和EMT等密切相关,发挥多种生物学功能,可能参与鼻咽癌发生发展的各个阶段。3)可能相关的瘤基因PTHLH过表达后显著促进了鼻咽癌细胞的体外增殖等能力,可能与CDK2等候选靶基因共同促进鼻咽癌的发生发展。