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AKT/PKB(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B)是负责许多生长因子和细胞因子下游信号传递的一个中枢分子,在调控细胞增殖与存活中发挥着至关重要的作用。AKT的过度活化与多种癌症的发生紧密关联。目前,虽然已经有大量分子被认为与AKT依赖的细胞转化和肿瘤发生相关,但是,转化细胞是否需要其他机制去适应机体检查压力而最终发生肿瘤仍然不是很清楚。TAK1(TGFβ-activated kinase,转化生长因子p活化激酶)是许多重要信号通路的上游,根据不同的组织类型和细胞环境,对肿瘤发生发展起着不尽相同的作用。目前,有关TAK1在AKT介导的肿瘤发生中的作用却知之甚少。本研究立足于此,旨在探讨AKT依赖的肿瘤形成过程是否需要TAK1的存在。本研究发现,通过dnTAK1(dominant negative form of TAK1)的表达,抑制AKT转化的p53-/-鼠胚胎肝细胞(LPCs)和NIH3T3细胞中TAK1的功能,可以显著降低AKT1转化细胞的体内成瘤能力,这一效应并不完全出现在体外培养细胞中。抑制TAK1造成的AKT转化细胞的成瘤能力的削弱,在一定程度上可被抗氧化剂NAC(N-acetylcysteine)和CD8抗体所逆转。在体外培养的细胞中,抑制TAK1功能显著增加细胞对TNF-α和FasL介导的死亡的敏感性；含死亡结构域FAS相关蛋白的负显性突变体dnFADD (dominant negative form of Fas-Associated Death Domain)能够逆转dnTAK1增敏效应；在体内实验中,]PCs-AKT细胞中表达dnFADD未能有效地逆转dnTAK1的抑瘤生成作用。综上所述,TAK1在AKT介导的肿瘤形成过程中起着关键作用。本研究结果提示,对AKT依赖的肿瘤生成而言,TAK1功能的存在可能是转化细胞适应体内生存压力的需要,其功能抑制是一个潜在的治疗新策略。第一部分抑制TAKl功能对AKT1转化细胞体外作用的研究目的：构建稳定表达dnTAK1的细胞系,并且鉴定dnTAK1是否具有干扰细胞内源性TAK1的功能；探讨TAK1功能抑制对AKT1转化的细胞体外增殖和细胞对死亡信号的敏感性的影响,并对相关机制进行探讨。方法：利用逆转录病毒载体MSCV-Puro制备负显性突变体dnTAK1的病毒颗粒,体外感染Myrt-AKT1转化的p53-/-小鼠胚胎肝前体细胞和NIH3T3成纤维细胞。采用western技术检测AKT和dnTAKl的表达,并通过检测TNF α和ILl β刺激后TAK1下游MAPK信号通路(P65,P38,JNK,ERK)的活化状况来验证dnTAK1的有效性。采用MTT法检测TAK1功能抑制对AKT1转化细胞体外增殖能力的影响；同时在TNF家族不同的细胞因子刺激下(20ng/mL TNF α,400ng/mL TRAIL,100ng/mL FasL),检测细胞的存活率和凋亡率。结果：LPCs-AKT1和NIH3T3-AKT1细胞中AKT呈过表达,dnTAK1-Flag融合蛋白也成功表达于AKT转化细胞。在TNF α和IL1β刺激下,NIH3T3-AKT1-dnTAK1细胞中,P65和P38MAPK的活化都受到了显著地抑制；而在LPCs-AKT1-dnTAKl细胞中,TNF α刺激可延迟P38MAPK的活化,并可轻度地抑制P65的磷酸化。另外,dnTAK1的表达对3T3-AKT1细胞的增殖有一定的抑制作用；但是对LPCs-AKT1细胞却没有明显抑制。在20ng/mL TNF α或者10Ong/mL FasL刺激下, dnTAK1的表达增加了LPCs-AKT1细胞和3T3-AKT1对死亡信号的敏感性并且和ROS水平的增加有关；TAKl功能受到抑制的AKT转化细胞对于TRAIL引起的死亡仍呈现耐受性。结论：建立了稳定表达dnTAK1的LPCs-AKT1和NIH3T3-AKT1细胞系,证明了TAKl具有干扰细胞内源性TAK1的功能。dnTAKl能在一定程度上抑制3T3-AKT1细胞的体外增殖,但不能影响LPCs-AKT1细胞；TAKl功能受到抑制时,能通过上调ROS水平增加LPCs-AKT1和NIH3T3-AKT1细胞对TNF Q和FasL引起的死亡的敏感性。第二部分抑制TAK1l对AK1转化细胞体内肿瘤形成能力的影响目的：探讨TAK1在AKT1转化细胞体内成瘤过程中的作用。方法：通过皮下荷瘤模型,监测并记录LPCs-AKT1-dnTAK1和LPCs-AKT1-control细胞在C57BL/6小鼠和免疫缺陷的BALB/C-Nu/Nu裸鼠体内成瘤所需要的时间。此外,我们还观察了NIH3T3-AKT1-dnTAK1和NIH3T3-AKT1-control细胞在BALB/C-Nu/Nu裸鼠体内的成瘤能力。结果：在接种裸鼠中,LPCs-AKT1-dnTAK1细胞成瘤所需平均时间为22.5±4.6天,而对照细胞在小鼠中成瘤所需时间仅为9.6±2.0天,两者差异显著(P=0.003);在免疫功能正常的C57BL/6中,这种差异性更为明显,LPCs-AKT1-dnTAK1细胞和对照细胞成瘤所需时间分别为47.4±9.0和10.6±2.0(p<0.001)。不仅如此,在所观察的时间里,InTAKl表达的LPCs-AKTl细胞的成瘤率为43.75%,而对照组为100%。3T3-AKT1细胞中TAK1的抑制,可导致细胞在裸鼠体内的成瘤时间显著延长,dnTAKl表达组和对照组中肿瘤出现的平均时间分别为43±16和31±3天(p=0.048)。结论：TAK1功能抑制削弱AKT1转化细胞的体内成瘤能力。第三部分TAKl调控AKT1转化细胞体内成瘤能力机制的初步研究目的：初步探索dnTAK1抑制LPCs-AKT1细胞成瘤能力的相关机制。方法：1.利用逆转录病毒载体构建MSCV-IRES-dsRed-dnFADD,通过病毒感染,建立四株不同的稳定细胞系,分别命名为LPCs-AKTl-control-MiR, LPCs-AKTl-control-dnFADD, LPCs-AKT1-dnTAKl-MiRt和LPCs-AKT1-dnTAKl-dnFADD,通过比较它们在C57BL/6小鼠和BALB/C-Nu/Nu裸鼠体内成瘤能力的差异性,确定FADD依赖的死亡途径在dnTAK1介导的抗肿瘤过程中的作用。2.分别利用流式细胞仪和western检测肿瘤组织中LPCs-AKT1-dnTAK1和LPCs-AKT1-control细胞内的ROS水平和肿瘤组织中NOX4的表达,观察在抗氧化剂NAC处理下,各组细胞在裸鼠成瘤能力上的变化。3.利用中和抗体特异性去除C57BL/6小鼠体内的CD4+,CD8+T细胞,观察去除不同T细胞对dnTAK1组AKTl转化细胞成瘤能力的影响,同时检测小鼠脾脏和肿瘤组织中CD4+,CD8+T细胞的去除效率。结果：1.dnFADD的表达在体外能够完全阻断TNF Q和FasL对LPCs-AKT1-dnTAK1细胞的杀伤,但是,在C57BL/6体内不能有效地缩短LPCs-AKT1-dnTAK1细胞形成肿瘤所需要的时间；在裸鼠中也未显现显著的效应,LPCs-AKT1-dnTAK1-MiR组和LPCs-AKT1-dnTAK1-MiR-dnFADD组的成瘤时间分别为45.5±10天和39.8±5天。2.相对于对照组而言,LPCs-AKT1-dnTAK1细胞中ROS水平明显上升,NOX4的表达量也明显增加；抗氧化剂NAC的处理在一定程度上回复了dnTAK1对肿瘤形成的抑制作用,LPCs-AKT1-dnTAK1-MiR-NAC组和LPCs-AKT1-dnTAK1-MiR-PBS组的成瘤时间分别为40.0±10.6天和48.4±12.6天(p=0.025)；不仅如此,在成瘤率上也有所增加,LPCs-AKT1-dnTAK1-MiR-NAC组和LPCs-AKT1-dnTAK1-MiR-PBS组的成瘤率分别为100%和70%。3.在监测肿瘤形成和发展的过程中,发现CD8+T细胞中和抗体能够很大程度地削弱dnTAK1的抑癌效应,与PBS处理组相比,肿瘤出现的时间分别为22.4±1天和30.4±5天,但是CD4+T细胞中和抗体对肿瘤的抑制作用不明显,没有统计学上的显著差异。结论：TAK1促进LPCs-AKT细胞的肿瘤形成能力与调节转化细胞的ROS水平和CD8+T细胞介导的反应性有关。