目的：体外分离、培养、鉴定SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、雪旺细胞(Schwann cells, SCs),将脂肪干细胞诱导分化为雪旺样细胞(Schwann-like cells),制备SD大鼠去细胞神经支架,为下一步实验提供种子细胞及支架材料。方法：无菌条件下切取4周龄SD大鼠双侧腹股沟脂肪垫,应用胶原酶Ⅰ消化40分钟,分离大鼠ADSCs,进行体外培养、传代,倒置显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,诱导成骨、成脂,分别进行碱性磷酸酶(ALP)、茜素红、von Kossa染色及油红0染色,绘制生长曲线及用流式细胞仪检测细胞表面标记。使用多聚-L-赖氨酸,福斯高林,全反式维甲酸,β-巯基乙醇,碱性成纤维细胞生长因子,血小板源性生长因子及神经生长因子,将第三代脂肪干细胞诱导分化为雪旺样细胞,并使用荧光定量PCR检测S100B及神经胶原纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein GFAP)基因表达水平、免疫组化染色检测胞浆中S100β及GFAP蛋白。无菌条件下切取4周龄SD大鼠双侧坐骨神经,剪碎后应用胶原酶Ⅰ消化15分钟,将消化后的组织块直接接种于培养瓶,进行体外培养、传代纯化SCs,倒置相差显微镜观察细胞的生长增殖及形态变化,逆转录多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)检测S100β及GFAP基因的表达情况、免疫组化法检测S100β及GFAP蛋白。无菌条件下切取成年SD大鼠双侧坐骨神经,应用TritonX-200. SB-16和SB-20处理,使神经内的细胞及细胞成分去除,留下细胞外基质,构建去细胞神经支架,并进行支架切片HE染色、支架电镜扫描,观察支架的细胞去除情况及支架的空间结构。结果：体外培养的ADSCs呈梭形,增殖活跃,传代后形态均一,多次传代后细胞仍保持较强增殖能力；生长曲线呈“S”型；成骨诱导实验组碱性磷酸酶(ALP)、茜素红、von Kossa染色阳性,成脂诱导实验组油红0染色阳性；对照组均为阴性。CD29. CD44、CD105表达阳性,且表达率均在98%以上,CD3、CD45表达阴性。第三代ADSCs诱导为雪旺样细胞的结果显示,诱导第一周开始出现双极细胞,第二周神经球出现,第三、第四周神经球增多,多数细胞呈双极或多极生长,具有雪旺细胞的外观特征,荧光定量PCR显示诱导第三周时S100β、GFAP基因的表达倍数最高,分别达4.76和2.99倍,免疫组化染色也显示第三周时S100β及GFAP蛋白阳性率接近最高,分别为92.09%和90.19%。组织块法培养的坐骨神经组织块旁24小时内即有细胞长出,72小时后即形成细胞集落,细胞外形多为双极、梭形,RT-PCR结果显示细胞表达S100β、GFAP基因,免疫组化染色结果表明S100p及GFAP蛋白在胞浆中含量丰富,细胞纯度约为92%。去细胞神经支架的HE染色结果显示神经内的细胞去除彻底,只留下细胞外基质,电镜扫描结果亦显示细胞已去除,留下细胞外基质形成的孔隙结构。结论：SD大鼠腹股沟脂肪垫分离的ADSCs在体外易于分离培养和传代扩增,特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,并表达间充质干细胞相关的表型,CD29、CD44、CD105表达率均在98%以上,说明所分离培养的细胞中ADSCs纯度高,细胞均一性好,可做为种子细胞的来源。ADSCs诱导三周后,荧光定量PCR显示S100β、GFAP基因表达上调倍数最高,说明转录水平最高；免疫组化结果显示细胞的S100β及GFAP阳性率也接近最高,且此时细胞活性较高,可用于修复SD大鼠坐骨神经缺损的下一步研究。单酶消化法复合植块法可以快速获得高纯度、高活性的SCs,并从基因及蛋白水平进行了鉴定,为神经功能的修复与重建提供了高质量的种子细胞,可做为下一步实验的阳性对照细胞。经化学试剂去细胞处理的神经支架细胞去除彻底,留下由细胞外基质构成的孔隙结构,为下一步实验提供了理想的去细胞神经支架。目的：使用雪旺样细胞复合去细胞神经支架修复SD大鼠坐骨神经缺损并观察其效果,探讨修复周围神经缺损的可行方法。方法：将40只SD大鼠(雌雄各半)随机分成4组,每组10只,分别为实验组：去细胞神经支架+雪旺样细胞(Schwann-like cells),阳性对照组：去细胞神经支架+雪旺细胞(SCs),阴性对照组：去细胞神经支架+脂肪干细胞(ADSCs),空白对照组：去细胞神经支架。取SD大鼠左侧的坐骨神经为手术侧,制造10mm坐骨神经缺损模型,在显微镜下分多点分别将雪旺样细胞、SCs、ADSCs注入神经支架内之后,直接将神经支架用于桥接修复坐骨神经缺损。术后评估指标包括：术后观察足部溃疡发生、愈合等一般情况,检测肢体感觉功能恢复情况,神经行为学检测步态恢复情况,神经电生理检测神经传导速度,腓肠肌湿重恢复率检测肌肉萎缩情况及神经组织学检测神经内细胞生长情况。通过上述指标综合评估术后大鼠肢体功能恢复情况,数据使用SPSS13.0软件包进行分析,采用LSD-t检验比较组间修复效果的差异性。结果：术后手术侧即出现足下垂畸形,1周内各组手术侧足均出现自噬现象,术后3周各组均出现术侧足部溃疡,术后6-8周足部溃疡开始愈合,愈合最快的是阳性对照组,术后6周时溃疡基本全部愈合,其次是实验组,第7周时已基本愈合,愈合最慢的是空白对照组,术后第8周才逐渐愈合。术侧肢体感觉功能检测结果显示,术后1-3周时对热刺激几乎无反应,术后4-6周是对热刺激开始出现反应,其中最早出现反应的是阳性对照组,其次为实验组,阴性对照组和空白对照组最迟出现对热刺激的反应,术后12周的测定结果显示,各组的感觉功能均有恢复,对热刺激回缩反应时间的由短到长依次是阳性对照组、实验组、阴性对照组、空白对照组,空白对照组与其他3组相比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与实验组、阳性对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；实验组与阳性对组比较,差异无统计学意义(P=0.717)。神经行为学观察可见,术后1-2周行走时手术侧出现足下垂并各趾屈曲畸形,步态异常,术后6-8周各组术侧足趾逐渐张开,并可着地行走,术后12周测定坐骨神经功能指数(Sciatic function index, SFI)显示,各组均有恢复,阳性对照组及实验组恢复较好,两者比较差异无统计学意义(P=0.577),且该两组恢复情况较阴性对照组和空白对照组好(P<0.05)。术后12周手术侧神经电生理检测神经传导速度结果显示,阳性对照组神经传导速度最快,实验组次之,空白对照组最慢,空白对照组与其他3组相比较,差异均有统计学意义(P<0.05)；阴性对照组与实验组、阳性对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；实验组与阳性对组比较,差异无统计学意义(P=0.891)。术后12周切取各组手术侧及正常侧的腓肠肌比较,大体观可见空白对照组手术侧的腓肠肌较正常侧明显偏小,实验组与阳性对照组的双侧腓肠肌大小相当,阴性对照组手术侧的腓肠肌较正常侧的稍小,各组腓肠肌湿重恢复率测定结果显示,实验组及阳性对照组恢复较好,两组比较差异无统计学意义(P=0.155),各组与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。神经组织学观察可见各组移植的神经表面光滑,完整性良好,与邻近的组织均有粘连,缝合端未见明显膨大,神经切片HE染色可见实验组、阳性对照组及阴性对照组神经内均有较多细胞,神经内组织排列规则,空白对照组细胞较少,神经内组织排列欠规则。结论：将脂肪干细胞诱导为雪旺样细胞后复合去细胞神经支架修复SD大鼠l0mm的坐骨神经缺损,术后检测各项指标显示,各组均有修复效果,实验组与阳性对照组的各项检测指标均优于空白对照组及阴性对照组,说明修复效果优于空白对照组及阴性对照组,而实验组与阳性对照组的各项检测指标差异无统计学意义,提示雪旺样细胞的修复效果与雪旺细胞的修复效果相当。由此可见,脂肪干细胞诱导的雪旺样细胞复合去细胞神经支架后可修复SD大鼠10mm的坐骨神经缺损。