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第一部分小分子dsRNA介导的大鼠肝细胞系BRL中诱导型一氧化氮合酶基因表达上调的实验研究【目的】应用RNA激活技术激活大鼠肝细胞系BRL中诱导型一氧化氮合酶基因的表达,筛选出有效的激活序列,进一步证明了该现象普遍存在于哺乳动物细胞中【方法】在Ensemble基因库里找到大鼠iNOS基因的启动子序列，然后在dbTSS(http://dbtss.hgc.jp),AceView(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly)和UCSC(http://genome.ucsc.edu)基因数据库中分析启动子区域需要剔除的基因序列，确定基因转录起始位点。将iNOS启动子靶序列输入根据RNA激活原则设计的软件中,设计并化学合成了3条靶向大鼠iNOS基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子以及1条阴性对照(?)(saRNA-1,saRNA-2,saRNA-3以及saRNA-control)采用脂质体法lipofectamineTM2000转染入大鼠肝细胞系BRL。转染后72h收集转染的细胞,采用RT-PCR法,Western-blot法检测细胞内iNOS的mRNA和蛋白的表达【结果】大鼠肝细胞系BRL转染羟基荧光素(FAM)标记的saRNA后，70%以上细胞内有绿色荧光表达。在细胞转染72h后采用半定量RT-PCR和Western-blot检测显示，saRNA-2转染后能够激活大鼠肝细胞系BRL内诱导型一氧化氮合酶基因的mRNA和蛋白的表达,其他saRNA转染后均未见激活现象【结论】利用RNA激活技术可成功激活大鼠肝细胞BRL细胞株iNOS基因的表达并为应用RNA激活技术打下实验基础。【目的】构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(?)(EGFP)标记针对大鼠诱导型一氧化氮合酶基因的shRNA重组腺病毒载体并在人胚肾-293细胞中扩增制备重组腺病毒【方法】根据前期研究得到的靶向大鼠iNOS基因启动子序列并有激活作用的的saRNA-2,设计并合成shRNA寡核苷酸片段。将其退火后形成双链并克隆进入穿梭质粒pDC316-EGFP-U6中,构建重组质粒,并进行PCR鉴定,酶切鉴定以及测序分析。利用AdMax腺病毒包装系统，将构建好的带有EGFP标记基因的穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP载体，与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre同时转染人胚肾-293细胞，经过同源重组得到复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-iNOS-shRNA-EGFP。再进一步将此病毒感染293细胞进行病毒扩增，采用离子交换法纯化病毒并检测纯化后病毒滴度及颗粒数。【结果】经聚合酶链反应(PCR)检测，限制性酶切分析及测序测定，证明已成功构建了重组穿梭质粒pDC316-iNOS-shRNA-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-iNOS-shRNA-EGFP:(?)将重组腺病毒扩增纯化后检测病毒颗粒数为3.6×10 11VP/ml,A260/A280值约为1.25,病毒活性为7.94×10 9IU/ml。【结论】已成功构建重组腺病毒载体Ad5-iNOS-shRNA-EGFP,纯化病毒液量和滴度符合体内体外基因转染实验要求,为利用基因激活技术治疗勃起功能障碍的研究奠定了基础。第三部分腺病毒介导的shRNA上调大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iNOS表达激活NO/cGMP通路的实验研究【目的】探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iNOS基因的激活作用，为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据【方法】将前期构建的重组腺病毒Ad5-iNOS-shRNA-EGFP(AdU6/shiNOS)和对照病毒AdU6/shControl,分别转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,分别在不同病毒MOI(25,50,75)值下72小时后采样检测。采用realtime RT-PCR半定量检测AdU6/shiNOS对细胞iNOS基因mRNA表达影响；western-blot法检测海绵体平滑肌细胞iNOS蛋白表达变化。然后培养基中加L-Arg(10mmol/L),用酶联免疫法检测病毒转染72h后海绵体平滑肌细胞内cGMP的浓度变化,记录AdU6/shiNOS对平滑肌细胞内cGMP的影响。【结果】AdU6/shiNOS转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞72小时后,和空白对照组、阴性对照组相比iNOS基因在mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P<0.05),呈剂量依赖性，MOI-75时RNAa效果最好。而且转染72h后，实验组原代平滑肌细胞内cGMP水平显著高于对照组及空白组(P<0.05)【结论】利用腺病毒介导的RNAa技术，提高海绵体平滑肌细胞iNOS基因表达获得成功,可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平，激活了NO/cGMP通路,这为勃起功能障碍的基因治疗研究开辟了新的方向。