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由于缺血性脑卒中后中枢神经难以自我修复,因此患者往往遗留不同程度的运动和感觉等神经功能障碍,严重影响患者及家属的正常生活。组织纤溶酶原激活剂（tissue plasminogen activator,t PA）是临床公认的治疗药物,由于治疗时间窗狭窄和副作用的局限性,在临床中并不能得到广泛应用。因此,寻求有效的促进神经修复、提高生存质量的药物成为亟待解决的难题。近数十年研究发现成年哺乳动物中枢神经系统（Central nervous system,CNS）存在自我修复,轴突的有效再生、并与周围神经组织重新建立连接,对神经功能恢复起着至关重要的作用。然而,由于损伤部位微环境中存在大量的轴突再生抑制因子,导致轴突无法有效再生、神经难以修复。在众多抑制因子中,Nogo-A最为关键,Nogo-A与受体结合后激活下游Rho A/ROCKII信号通路,活化的ROCKII促进下游分子肌球蛋白轻链（Myosin light chain,MLC）的磷酸化,进而引起细胞骨架重排、生长锥塌陷并最终抑制轴突再生。可见,Nogo-A/Ng R1/Rho A/ROCKⅡ/MLC信号通路在神经修复中发挥了关键的负调节作用。因此,能够靶向抑制Nogo-A及其信号通路表达的药物,有望用于缺血性脑卒中的治疗。缺血性脑卒中属于中医学“中风”范畴,临床多为气虚血瘀,治疗以补气活血为主。本课题组认为,本病的基本病机为“气血亏虚,血行瘀滞”,治疗应在补气活血的基础上着重养血生血,以期达到气血双补、养血活血、和血生络之目的。在古方新用的原则指导下,以人参养荣汤为基础方化裁出和血生络方,在临床中取得了良好的疗效。前期研究表明,和血生络方对缺血性脑卒中具有良好的神经保护作用,与促进脑缺血后血管新生和神经重塑有关。然而,和血生络方是否能够在脑缺血后促进皮层的轴突再生及其机制尚未见报道,这正是本研究的目的。本研究通过三部分动物实验,探讨和血生络方能否通过抑制Nogo-A/Ng R1/Rho A/ROCKⅡ/MLC信号通路的激活来促进局灶性脑缺血大鼠皮层的轴突再生,进而证实和血生络方对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用。第一部分和血生络方对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用目的:通过对和血生络方干预后局灶性脑缺血大鼠的m NSS行为学评测、网屏实验、TTC染色、HE染色和尼氏染色的测定,观察和血生络方对局灶性脑缺血大鼠的神经保护作用。方法:选取SD大鼠,健康成年雄性,体重250-280g,采用线栓法制备永久性大脑中动脉闭塞模型（p MCAO）。将SD大鼠随机分为假手术组（Sham）:动物接受假手术和等体积生理盐水;假手术+HXSL组（Sham+HXSL）:动物接受假手术并给予15.3mg/kg和血生络方;模型组（Vehicle）:动物接受p MCAO和等体积生理盐水;HXSL组（HXSL）:动物接受p MCAO并给予15.3g/kg和血生络方;法舒地尔组（Fasudil）:动物接受p MCAO并给予10mg/kg FH和丹参酮ⅡA组（TSA）:动物接受p MCAO并给予20mg/kg TSA。各组大鼠分别于造模前及造模后第3、7、14、21和28天进行m NSS评分、网屏实验和一般状态观察;于造模后第7天进行TTC染色测定脑梗死体积;于术后第7天和第14天通过HE染色和尼氏染色观察脑组织形态学变化并测定完整神经元数量。结果:1.造模后Sham组和Sham+HXSL组大鼠很快恢复如常;各造模组大鼠术后均出现精神萎靡、反应迟钝、喜蜷缩、皮毛色暗干枯、饮食及排便减少等状态。与Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组大鼠在精神状态、灵活程度、摄食排便及体重等方面均明显改善。2.m NSS评分结果显示:在造模后第3、7、14、21和28天,Sham组和Sham+HXSL组大鼠评分均为0,表示两组大鼠均无神经功能异常;与Sham组相比,Vehicle组评分明显提高（P<0.01）;从造模后第3天至28天,与同期Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组的神经功能评分均明显降低（P<0.01）。3.网屏实验结果显示:在造模后的各时间段里,Sham组和Sham+HXSL组大鼠评分均为0,提示两组大鼠肌力均无异常改变;与Sham组相比,Vehicle组评分明显提高（P<0.01）。与Vehicle组相比,HXSL组大鼠评分自造模后第7天明显降低（P<0.01）并一直持续到造模后第28天;Fasudil组和TSA组大鼠评分在造模后第14、21和28天明显降低（P<0.05或P<0.01）。网屏实验结果趋势与m NSS神经功能评分一致。4.TTC染色结果显示:在造模后第7天,Sham组和Sham+HXSL组大鼠脑部均无梗死灶;与Sham组相比,Vehicle组大鼠脑梗死体积明显增加（P<0.01）;与Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组大鼠脑梗死体积明显减少（P<0.01）。5.HE染色结果显示:在缺血后第7天和14天,Sham组和Sham+HXSL组大鼠梗死周围皮层区细胞结构、形态均正常,两组无明显差异;与Sham组相比,Vehicle组细胞结构形态均被破坏、变性坏死细胞明显增多;与同期Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组细胞损伤程度明显减轻、变性细胞明显减少。6.尼氏染色结果显示:在缺血后第7天和14天,Sham组和Sham+HXSL组大鼠梗死周围皮层区神经细胞排列规则、结构完整,两组神经元数量无明显差异（P>0.05）;与Sham组相比,Vehicle组神经细胞排列松散,结构模糊,神经元数量明显减少（P<0.01）;与同期Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组神经细胞形态结构明显改善,神经元数量明显增加（P<0.01）。小结:1.本实验通过线栓法成功建立大鼠p MCAO模型,证实和血生络方可以明显改善局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损表现,促进脑缺血大鼠神经功能恢复。2.和血生络方能够明显减少局灶性脑缺血大鼠脑梗死体积,减轻梗死周围皮层区病理损伤,具有显著的神经保护作用。第二部分和血生络方对局灶性脑缺血大鼠轴突再生的影响目的:通过观察测定和血生络方干预后局灶性脑缺血大鼠皮层内的轴突生长情况及轴突再生相关标志物NF200及GAP-43的表达情况,探讨和血生络方对局灶性脑缺血大鼠皮层内轴突再生的影响。方法:选取SD大鼠,健康成年雄性,体重250-280g,采用线栓法制备永久性大脑中动脉闭塞模型（p MCAO）。将SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、假手术+HXSL组（Sham+HXSL）、模型组（Vehicle）、HXSL组（HXSL）、法舒地尔组（Fasudil）和丹参酮ⅡA组（TSA）。各组大鼠分别于造模后第7、14和28天应用免疫荧光技术观察轴突形态、生长情况并检测NF200的表达;蛋白质印迹法（Western blot）检测GAP-43的表达;实时荧光定量PCR（q RT-PCR）技术检测GAP-43和NF200的m RNA水平变化。结果:1.免疫荧光检测轴突形态、长度结果显示:在术后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组较同期Sham组相比形态相近,两组轴突长度差异不明显（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组轴突结构破碎呈片段状、长度明显减少（P<0.01）;HXSL组、Fasudil组和TSA组均能明显改善轴突形态结构,长度均明显增加（P<0.01）。2.梗死周围皮层内NF200的蛋白及m RNA水平免疫荧光结果显示:在术后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组与Sham组大鼠梗死周围皮层内NF200表达相近,差异无统计学意义（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组NF200蛋白表达明显降低（P<0.01）;HXSL组、Fasudil组和TSA组较Vehicle组相比均能显著升高皮层内NF200的表达（P<0.05或P<0.01）。q RT-PCR检测结果显示:在术后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组与Sham组大鼠梗死周围皮层内NF200 m RNA水平相近,差异无统计学意义（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组NF200的m RNA水平明显降低（P<0.01）;HXSL组、Fasudil组和TSA组较Vehicle组均能显著升高皮层内NF200的m RNA水平（P<0.01）。3.梗死周围皮层内GAP-43的蛋白及m RNA水平Western blot检测结果显示:在术后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组与Sham组大鼠梗死周围皮层内GAP-43蛋白含量相近,差异无统计学意义（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组GAP-43蛋白表达升高（P<0.01）;HXSL组、Fasudil组和TSA组较Vehicle组均能明显上调皮层内GAP-43蛋白的表达（P<0.01）。q RT-PCR检测结果显示:在术后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组与Sham组大鼠梗死周围皮层内GAP-43 m RNA水平相近,差异无统计学意义（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组GAP-43 m RNA水平升高（P<0.01）;HXSL组、Fasudil组和TSA组较Vehicle组均能显著升高皮层内GAP-43的m RNA水平（P<0.01）。小结:1.和血生络方可以改善局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层部位的轴突形态、促进轴突的生长延伸。2.和血生络方能够明显增强局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层部位NF200和GAP-43的蛋白和m RNA水平,具有显著的促进缺血后轴突再生的作用。第三部分和血生络方对局灶性脑缺血大鼠Nogo-A/Ng R1/Rho A/ROCKII/MLC信号通路的影响目的:通过观察测定和血生络方干预后局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层部位Nogo-A、Ng R1、Rho A、ROCKⅡ、MLC和p-MLC蛋白及m RNA的表达情况,探讨和血生络方对局灶性脑缺血大鼠Nogo-A/Ng R1/Rho A/ROCKII/MLC信号通路的影响。方法:选取SD大鼠,健康成年雄性,体重250-280g,采用线栓法制备永久性大脑中动脉闭塞模型（p MCAO）。将SD大鼠随机分为假手术组（Sham）、假手术+HXSL组（Sham+HXSL）、模型组（Vehicle）、HXSL组（HXSL）、法舒地尔组（Fasudil）和丹参酮ⅡA组（TSA）。各组大鼠分别于造模后第7、14和28天应用Western blot及q RT-PCR技术检测皮层中Nogo-A、Ng R1、Rho A、ROCKⅡ、MLC和p-MLC的蛋白及m RNA水平变化。结果:1.Western blot结果显示:在造模后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组与Sham组大鼠梗死周围皮层内Nogo-A、Ng R1、Rho A、ROCKⅡ和p-MLC的蛋白水平相近、差异无统计学意义（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组皮层内Nogo-A、Ng R1、Rho A、ROCKⅡ和p-MLC的蛋白水平明显升高（P<0.01）;与同期Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组均能明显降低以上这些蛋白的表达（P<0.05或P<0.01）;在造模后各时间段内,各组大鼠MLC的蛋白表达均无明显差异（P>0.05）。2.q RT-PCR结果显示:在造模后第7天、14天和28天,Sham+HXSL组与Sham组大鼠梗死周围皮层内Nogo-A、Ng R1、Rho A和ROCKⅡ的m RNA水平相近、差异无统计学意义（P>0.05）;与同期Sham组相比,Vehicle组皮层内Nogo-A、Ng R1、Rho A和ROCKⅡ的m RNA水平明显升高（P<0.01）;与同期Vehicle组相比,HXSL组、Fasudil组和TSA组皮层内Nogo-A、Ng R1、Rho A和ROCKⅡ的m RNA水平明显降低（P<0.01）;在造模后各时间段内,各组大鼠MLC的m RNA水平均无明显差异（P>0.05）。小结:1.和血生络方能够明显下调局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层内Nogo-A、Ng R1、Rho A、ROCKⅡ和p-MLC蛋白及m RNA的表达,抑制该信号通路的激活。2.结合前两部分实验的结果,提示和血生络方可能通过抑制Nogo-A/Ng R1/Rho A/ROCKⅡ/MLC信号通路的激活来促进局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层内轴突再生,从而对脑缺血大鼠起到神经保护的作用。结论:1.本实验通过线栓法成功建立大鼠p MCAO模型,证实和血生络方能够显著改善局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损症状、减少脑梗死体积并减轻梗死周围皮层区神经元损伤,对局灶性脑缺血大鼠具有良好的神经保护作用。2.和血生络方能够促进局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层内的轴突再生。3.和血生络方促进局灶性脑缺血大鼠梗死周围皮层内轴突再生、促进神经功能恢复的作用可能与下调Nogo-A/Ng R1/Rho A/ROCKⅡ/MLC信号通路相关信号分子的表达有关。