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大熊猫(Giant Panda)是世界上最濒危的物种之一,是我国特有的珍稀保护动物。近年来,我国已经采取了各种措施保护大熊猫,使其数量逐渐增加。小熊猫(Ailurusfulgens)属于国家二级保护动物,主要分布在喜马拉雅山脉和我国南部。目前,国内外对大熊猫和小熊猫病毒性传染病研究较少,该两种动物体内携带的病毒基因信息有限,至今已经发生多起大熊猫及小熊猫因为感染病毒性传染病致死的案例。长期以来,动物病毒学的研究主要集中于具有经济价值的家养动物,而且主要的研究也是基于已知的具有临床病理特征性的病毒,例如:犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)等,而对例如大熊猫和小熊猫这类珍稀国家保护动物的新发病毒性疾病研究非常少。传统的分子生物学检测方法只能对目前已知的病毒进行检测,很难发现未知病毒,因此有很多无法避免的局限性。基于二代测序技术的病毒宏基因组学(Viral Metagenomics)研究方法则很好地突破了这种局限性,它能以所给样品中全部病毒核酸为研究对象,既能有效探测存在的已知病毒,还能发现未知病毒。本研究用病毒宏基因组学方法,对大熊猫和小熊猫肠道病毒宏基因组进行初步探究。主要内容以及结果如下:首先,研究了大熊猫和小熊猫肠道病毒群落的组成状况:在对大熊猫肠道病毒群落组成的研究中,结果显示健康圈养大熊猫肠道病毒群落的组成主要包括:未分类病毒(Unclassified virus)31.52%、短尾噬菌体科14.48%、藻类去氧核糖核酸病毒科11.35%、Miniviridae科6.20%、小RNA病毒科5.99%、虹彩病毒科3.51%、番茄丛矮病毒科5.83%、Marseilleviridae2.71%、棒状病毒科2.66%、冠状病毒科1.57%、分体病毒科1.56%、逆转录病毒科1.54%、长尾噬菌体科1.48%、细小病毒科1.37%、肌病毒科1.14%、痘病毒科1.08%等组成。野生正常大熊猫的肠道主要病毒群落的组成主要是:未分类病毒(Unclassified virus)45.42%,小RNA病毒科39.27%、微小噬菌体科3.91%、细小病毒科2.15%、圆环病毒科2.12%、呼肠病毒科1.15%、花椰菜病毒科1.03%。未分类病毒(Unclassified virus)构成了大熊猫病毒群落的主体;在大熊猫的粪便中真核生物为宿主的病毒主要组成有:圆环病毒科(38.81%),小RNA病毒及其类似病毒科(30.07%),植物病毒科(19.53%),昆虫病毒科(11.46%)和指环状病毒科(0.13%)等。其中圆环病毒科在真核生物的病毒中所占比重最大。患病大熊猫与健康大熊猫个体肠道主要真核病毒群落比较中,患病野生大熊猫的小RNA病毒比例最高达到4.7%,而其他大熊猫组为0.1%-0.98%。在对圈养小熊猫肠道病毒群落的组成的研究中,显示小熊猫肠道中主要以未分类病毒以及噬菌体为主(73.06%),其次是昆虫病毒(16.15%),哺乳动物病毒(5.75%)以及植物病毒(5.05%);对小熊猫的病毒文库中真核生物病毒的群落组成状况进行分析,主要由Genomoviridae(62.03%)、昆虫病毒(22.33%)、植物病毒(6.98%)、小DNA病毒(3.69%)、圆环病毒科(3.53%)、小RNA类似病毒(0.82%)、小RNA病毒组成(0.62%)其次,对大熊猫及小熊猫肠道发现的新型病毒进行了研究:在对大熊猫新型圆环病毒的研究中,从大熊猫的粪便样品中发现了4种新型的圆环病毒(命名为Gpc V1、Gpc V2、Gpc V3和Gpc V4),运用病毒宏基因组学和生物信息学技术得到了4个圆环病毒的全基因组并对其进行了基因组结构的分析,4个病毒均含有Putative viral replication protein(Rep)和Capsid protein(Cap)两个标志性的开放性阅读框(ORF),在Rep和Cap的起始编码区之间存在着茎环结构。其中Gpc V2和Gpc V3各处含有一个大小分别为570bp和417bp的Putative Protein。在基于Rep氨基酸序列进行系统进化树的构建中可知,四种新型的大熊猫圆环病毒均与来自蝙蝠的Circovirus聚类。后续进行Circovirus的同源性比较中发现其与Genbank中相近的病毒Rep蛋白的同源性均小于70%,说明这四种圆环病毒属于新的种。在对小熊猫新型指环状病毒的研究中,在小熊猫的粪便样品种发现了一株新型的指环状病毒,命名为AV-Chengdu1,Gen Bank编号是No.KX611132。该指环状病毒基因组形状为环型,全长2900bp左右,包含3个ORF(ORF1、ORF2和ORF3),和一段分布在ORF2、ORF3之间大约300bp的高GC含量的TATA-BOX,这段序列不编码任何蛋白质。系统进化树分析结果AV-Chengdu1与来自松貂的指环状病毒(JN704611)聚类,并且与两株来自狗的指环状病毒和两株来自海豹的指环状病毒属于同一个进化分支。基于该毒株的特异型PCR引物筛选结果显示,在9个小熊猫的粪便样品中有2个粪便样品呈阳性。结论:运用病毒宏基因组学的方法初步探究了大熊猫及小熊猫肠道病毒群落的组成;大熊猫及小熊猫肠道病毒群落都呈现了病毒种类的多样性;大熊猫肠道发现了4个新型圆环状病毒,小熊猫肠道发现了1个新型指环状病毒。